背景[1-7]
膜結(jié)合DNA清除試劑盒是在無RNase的DNase的基礎上開發(fā)的、專門用于在柱式法總RNA抽提過程中，清除硅膠膜上基因組DNA污染的產(chǎn)品，
具有下列特點：1.快速，反應條件經(jīng)過優(yōu)化，能在5分鐘內(nèi)使硅膠膜上的基因組DNA降解。
2. 不含RNase，可以保證RNA分子完整性不受任何影響。
3. 兼容性廣，跟大多數(shù)柱式RNA提取試劑盒兼容，可以直接整合進去。不需要在提取到總RNA后再單獨去除里面的DNA污染。
4.可以處理各種細菌菌體，包括新鮮菌液或冰凍菌體沉淀。
5.在1.5mL塑料離心管中操作，適用于大規(guī)模的快速篩選。
6.采用溫和的中性裂解成分，蛋白保持天然活性。
7.產(chǎn)率是5-10 mg蛋白質(zhì)/mL細菌。
8.無須昂貴設備，無需溶菌酶、超聲波破碎等復雜的操作步驟，離心分離即可得到，簡單便捷。
9.得到的提取物可以直接用于SDS-PAGE、2D電泳、免疫印跡分析、蛋白活性測定和BCA法及Lowry法蛋白定量（不適用于Bradford法）。硅基質(zhì)吸附材料原理為在高鹽環(huán)境下質(zhì)粒DNA能夠結(jié)合到硅基質(zhì)上，然后用低鹽緩沖液或水將質(zhì)粒DNA從硅基質(zhì)上洗脫下來。得到的質(zhì)?？梢杂糜诿盖?、PCR、測序、細菌轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染等分子生物學實驗。
應用[8][9]
膜結(jié)合DNA清除試劑盒DNA主要包括植物、動物、微生物基因組DNA的提取與鑒定，哺乳動物組織總RNA的提取與鑒定，質(zhì)粒DNA的提取與鑒定，擴增，分子雜交技術，限制性內(nèi)切酶消化，分子克隆全過程和基因文庫的構(gòu)建等實驗項目中的DNA。抗菌肽(Antimicrobial peptides,AMPs)也稱為肽類抗生素(Peptideantibiotics)或天然抗生素(Natural antibiotics),是一類對細菌、真菌等微生物及某些昆蟲和動植物細胞具有抑制作用的小分子多肽。研究抗菌肽為開發(fā)新的抗菌素、抗病毒和腫瘤抑制劑開辟了廣闊的前景。
本實驗的目的旨在從銀杏果仁中分離純化出一種抗菌肽、對其性質(zhì)進行研究,并建立從銀杏種仁中反轉(zhuǎn)錄克隆cDNA的方法體系,為克隆基因和研究其抗菌機理奠定基礎。本實驗以銀杏種仁為研究材料,以常壓柱層析法、離心式離子交換層析加電洗法脫、AKTA柱層析法等三種方法從銀杏種仁中提取出一種抗菌肽,并對其純度、分子量、抗菌活性、熱穩(wěn)定性、對極端pH值的抗性、對高鹽濃度的抗性等性質(zhì)進行了分析。通過異硫氰酸胍法、TRIzoL法,CTAB法以及SDS法分別提取銀杏種仁的總RNA,建立反轉(zhuǎn)錄體系。
主要獲得以下結(jié)果:
1、三種方法純化出銀杏種仁抗菌肽,此蛋白在SDS-PAGE上顯示單條帶,表觀分子量為13000Da。AKTA柱層析法所得蛋白在雙向電泳中達到單點純。
2、該蛋白在離子交換層析中以高鹽濃度被洗脫,是一種堿性蛋白。對照其雙向電泳圖譜,其等電點在9.8左右。
3、純化的蛋白對黃瓜鐮刀孢菌(Fusarium oxysporum)辣、椒早疫病菌(Alternariasolani)、小麥赤霉病菌(Fusarium graminearum)、葡萄灰霉病菌(Botrytis cinereaPers)、黃瓜炭疽病菌(Colletotrichum lagenarium)等14種真菌有抑制作用。
4、該蛋白濃度達到2.5mg/ml以上即表現(xiàn)出明顯的抑菌活性。具有較高熱穩(wěn)定性,在90℃處理30min對黃瓜鐮刀孢菌抑菌活性無明顯變化。在酸性條件下,對供試的黃瓜鐮刀孢菌有很強的抑菌活性。對革蘭氏陽性菌代表菌金黃色葡萄球菌和革蘭氏陰性菌代表菌大腸桿菌均有一定的抑制作用。
5、CTAB法提取得總RNA純度高,完整性好,可用于反轉(zhuǎn)錄試驗。
參考文獻
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