背景[1-3]
NPC1L1抗體也稱為Niemann-Pick C1-Like 1抗體，是針對NPC1L1（Niemann-Pick disease,type C1,gene）-like 1）蛋白的特異性抗體。NPC1L1是一種在膽固醇代謝中起關鍵作用的膜蛋白，主要表達于小腸上皮細胞，參與膽固醇的吸收過程。NPC1L1抗體是用于科研和臨床診斷中的一種特異性抗體，它主要用于檢測和量化細胞表面蛋白NPC1L1的表達水平。NPC1L1蛋白在人體中扮演著重要的角色，特別是在膽固醇代謝和脂質(zhì)運輸過程中。在某些疾病狀態(tài)下，例如尼曼-皮克?。∟iemann-Pick disease）類型C，NPC1L1的功能喪失會導致脂質(zhì)積累，從而引發(fā)一系列健康問題。
NPC1L1抗體
一、基本信息
英文名：NPC1L1 Antibody
靶標：NPC1L1蛋白
宿主：多為Rabbit（兔），也有其他來源如小鼠等
克隆性：分為多克?。≒olyclonal）和單克隆（Monoclonal）兩種
形態(tài)：通常為凍干粉（Lyophilized）或液體（Liquid）形態(tài)
保存條件：一般推薦在-20℃或更低溫度下保存，避免反復凍融
二、應用范圍
NPC1L1抗體廣泛應用于生物學研究和臨床診斷中，包括但不限于：
Western Blot(WB)：用于檢測細胞或組織樣本中NPC1L1蛋白的表達水平
Immunoprecipitation(IP)：結(jié)合其他試劑進行免疫沉淀，用于純化NPC1L1蛋白或研究其與其他蛋白的相互作用
Immunofluorescence(IF)：在細胞中定位NPC1L1蛋白的分布
ELISA：定量檢測血清或其他生物液體中NPC1L1蛋白或其相關分子的濃度
三、抗體特性
免疫原：通常為NPC1L1蛋白或其特定片段的合成肽段
特異性：高度特異性地識別NPC1L1蛋白，減少非特異性結(jié)合
純度：經(jīng)過多種純化步驟，如親和純化等，以提高抗體的純度
四、供應商與價格
NPC1L1抗體由多家供應商提供，如Abnova、Covalab、immunoclone、ABCAM、BD、SANTA等。不同供應商提供的抗體在規(guī)格、價格、純度等方面可能存在差異。例如，Abnova提供的Npc1l1多克隆抗體產(chǎn)品貨號為PAB12092，價格需詢價，而Covalab提供的抗體則針對NPC1L1的不同區(qū)域。價格范圍從幾千元到上萬元不等，具體價格需根據(jù)供應商和購買數(shù)量等因素確定。
五、注意事項
在使用NPC1L1抗體前，請仔細閱讀產(chǎn)品說明書，了解抗體的具體信息、推薦稀釋比和實驗方法。
不同批次和來源的抗體可能存在差異，建議在使用前進行預實驗以確定最佳實驗條件。
抗體保存時應避免反復凍融，分裝可以最大限度減少凍融對抗體造成的損壞。
應用實例[4][5]
NPC1L1抗體可以用于利用CRISPR/Cas9技術體內(nèi)示蹤腸道膽固醇吸收中的NPC1L1內(nèi)吞囊泡
哺乳動物細胞胞外游離膽固醇的吸收主要是由尼曼匹克C1型樣蛋白1(Niemann–Pick type C1Like 1,NPC1L1)介導的囊泡內(nèi)吞途徑實現(xiàn)的。然而對NPC1L1介導膽固醇吸收的分子機制及其調(diào)節(jié)因素的認識還很有限。為可視化示蹤腸道內(nèi)源性NPC1L1介導的膽固醇吸收過程,本課題利用CRISPR/Cas9基因編輯技術,將多肽標簽FLAG和增強型綠色熒光蛋白(Enhanced green fluorescent protein,EGFP)引入到內(nèi)源性NPC1L1蛋白的C端,構建NPC1L1-FLAG-EGFP(NPC1L1-FG)小鼠,利用NPC1L1抗體等技術檢測分析NPC1L1-FG蛋白在小鼠不同組織中的表達特征,以明確改造后的內(nèi)源性NPC1L1蛋白的表達分布規(guī)律;分析NPC1L1-FG小鼠全身的脂代謝表型,以明確經(jīng)改造后的NPC1L1-FG蛋白是否影響膽固醇吸收及其代謝穩(wěn)態(tài)。在上述功能學驗證的基礎上,利用該小鼠模型示蹤分析腸道膽固醇吸收過程中的NPC1L1內(nèi)吞囊泡形成的時效和量效關系,以及膽固醇吸收抑制藥物依澤替米貝對NPC1L1-膽固醇內(nèi)吞囊泡形成的抑制作用。
方法:1.制備Cas9/單向?qū)NA(Single-guide RNA,sg RNA)質(zhì)粒:利用CRISPR/Cas9基因組編輯技術,針對小鼠NPC1L1基因的3’末端非編碼區(qū),設計不同sg RNA,利用細胞內(nèi)的熒光素酶法,檢測分析其Cas 9/sg RNA核酸酶活性,篩選出高活性的sg RNA序列,經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄制備sg RNA和Cas9 m RNA。2.構建打靶載體:PCR擴增小鼠NPC1L1基因靶點的兩側(cè)同源臂,長度均約為1.5 kb,與FLAG-EGFP編碼的c DNA一起克隆至打靶載體。3.經(jīng)酶切和測序鑒定正確的打靶載體DNA與sg RNA、Cas9 m RNA一起顯微注射入小鼠受精卵,移植至假孕小鼠體內(nèi)自然發(fā)育,生成NPC1L1-FG敲入小鼠。4.小鼠基因型鑒定:通過基因組DNA的PCR和Southern blot分析,篩選、鑒定重組正確且無隨機插入的子代小鼠。5.熒光顯微鏡可視化觀察和NPC1L1抗體Western blot檢測NPC1L1-FG蛋白在敲入小鼠各組織中的表達譜。6.基本代謝水平檢測:在高膽固醇飲食(HCD)喂養(yǎng)條件下,檢測野生型小鼠與NPC1L1-FG小鼠的體重、血糖、進食量、糞便量、血脂、肝臟以及小腸組織中的脂質(zhì)水平有無差異。7.探究NPC1L1-FG小鼠在膽固醇誘導下小腸上皮細胞中形成的內(nèi)吞囊泡數(shù)量的時效和量效關系。8.探究NPC1L1-FG小鼠在膽固醇誘導下小腸上皮細胞中形成的內(nèi)吞囊泡數(shù)量能否被膽固醇吸收抑制劑依澤替米貝所抑制。
NPC1L1抗體結(jié)果:1.成功構建了Npc1l1基因敲入打靶載體,并且制備了Cas9 m RNA和高活性的sg RNA,利用CRISPR/Cas9技術獲得了對內(nèi)源性NPC1L1蛋白C端進行FLAG和EGFP雙重標記的子代NPC1L1-FG小鼠。2.熒光顯微鏡下觀察和NPC1L1抗體Western blot實驗顯示NPC1L1-FG融合蛋白特異性地表達在模型小鼠的小腸組織的絨毛上皮細胞的刷狀緣,并以空回腸表達較為豐富。3.NPC1L1-FG的純合子小鼠與野生型小鼠具有相似的基本代謝表型和全身脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)。4.NPC1L1-FG純合子小鼠經(jīng)40mg/ml的膽固醇灌胃后5～60分鐘,其空腸中段上皮細胞在15分鐘時形成的NPC1L1-膽固醇內(nèi)吞囊泡數(shù)量最多。5.NPC1L1-FG純合子小鼠灌胃以0～40mg/ml的膽固醇15分鐘后,其空腸中段上皮細胞內(nèi)NPC1L1-膽固醇內(nèi)吞囊泡的形成具有劑量依賴性,20mg/ml時囊泡數(shù)量最多,40mg/ml時大囊泡的比例最高。6.依澤替米貝處理小鼠后,膽固醇誘導的小腸上皮細胞中內(nèi)吞囊泡的數(shù)量有降低的趨勢,但無統(tǒng)計學差異。
參考文獻
[1]Egg and cholesterol consumption and mortality from cardiovascular and different causes in the United States:A population-based cohort study.[J].Zhuang Pan;Wu Fei;Mao Lei;Zhu Fanghuan;Zhang Yiju;Chen Xiaoqian;Jiao Jingjing;Zhang Yu.PLoS medicine,2021
[2]Cryo-EM structures of NPC1L1 reveal mechanisms of cholesterol transport and ezetimibe inhibition.[J].Huang ChingShin;Yu Xinchao;Fordstrom Preston;Choi Kaylee;Chung Ben C;Roh SoungHun;Chiu Wah;Zhou Mingyue;Min Xiaoshan;Wang Zhulun.Science advances,2020
[3]Mechanisms and regulation of cholesterol homeostasis.[J].Luo Jie;;Yang Hongyuan;;Song Bao-Liang.Nature reviews.Molecular cell biology,2020
[4]Stigmasterol stimulates transintestinal cholesterol excretion independent of liver X receptor activation in the small intestine[J].Hannah C.Lifsey;;Rupinder Kaur;;Bradley H Thompson;;Lisa Bennett;;Ryan E.Temel;;Gregory A.Graf.The Journal of Nutritional Biochemistry,2020
[5]武曉靜.利用CRISPR/Cas9技術體內(nèi)示蹤腸道膽固醇吸收中的NPC1L1內(nèi)吞囊泡[D].天津醫(yī)科大學,2021.