背景^[1-7]

細(xì)胞免疫熒光檢測服務(wù)是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理，先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光素制成熒光標(biāo)記物，再用這種熒光抗體（或抗原）作為分子探針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原（或抗體）。在細(xì)胞或組織中形成的抗原抗體復(fù)合物上含有熒光素，利用熒光顯微鏡觀察標(biāo)本，熒光素受激發(fā)光的照射而發(fā)出明亮的熒光（黃綠色或桔紅色），可以看見熒光所在的細(xì)胞或組織，從而確定抗原或抗體的性質(zhì)、定位，以及利用定量技術(shù)測定含量。

免疫熒光技術(shù)（Immunofluorescence technique）是在免疫學(xué)、生物化學(xué)和熒光成像系統(tǒng)基礎(chǔ)上建立起來的檢測技術(shù)。技術(shù)原理是根據(jù)抗體-抗原特異結(jié)合，以熒光標(biāo)記抗體示蹤組織或細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)抗原。免疫熒光技術(shù)因特異性強(qiáng)、靈敏度高和操作簡便的優(yōu)勢廣泛應(yīng)用于免疫學(xué)、微生物學(xué)、病理學(xué)、腫瘤學(xué)以及臨床檢驗等生物學(xué)和醫(yī)學(xué)。

免疫學(xué)的基本反應(yīng)是抗原-抗體反應(yīng)。由于抗原抗體反應(yīng)具有高度的特異性，所以當(dāng)抗原抗體發(fā)生反應(yīng)時，只要知道其中的一個因素，就可以查出另一個因素。免疫熒光技術(shù)就是將不影響抗原抗體活性的熒光色素標(biāo)記在抗體（或抗原）上，與其相應(yīng)的抗原（或抗體）結(jié)合后，在熒光顯鏡下呈現(xiàn)一種特異性熒光反應(yīng)。

技術(shù)流程：

1.細(xì)胞爬片：將細(xì)胞按20%-30%的匯合度接種到24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的圓形蓋玻片上。

2.細(xì)胞固定：4%冷的多聚甲醛固定20分鐘，PBS洗三遍。

3.細(xì)胞通透：Triton X-100通透20分鐘，PBS洗三遍。

4.封閉：用與二抗相同宿主的血清封閉30分鐘，PBS洗三遍。

5.一抗孵育：一抗4度濕盒內(nèi)過夜，也可37度2小時，PBS洗三遍。

6.二抗孵育：二抗室溫孵育2小時或者37度1.5小時（避光），PBS洗三遍。

7.DAPI染核：在二抗孵育1小時后加入終濃度為100ng/ml的DAPI繼續(xù)孵育。然后可在熒光顯微鏡下觀察或直接封片保存。

8.甘油封片：在載玻片上滴一小滴甘油，小心地將細(xì)胞爬片從細(xì)胞培養(yǎng)板中取出來，種植有細(xì)胞的一面朝下輕輕的蓋在甘油上，避免產(chǎn)生過氣泡。4度孵育過夜晾干。

應(yīng)用^[8][9]

細(xì)胞免疫熒光檢測服務(wù)可用于循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測：

外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells,CTCs)存在于多種惡性腫瘤中,其檢測對于腫瘤早期診斷、預(yù)后分析、療效檢測以及個體化治療等眾多方面具有重要的臨床意義,并因能夠?qū)崟r檢測、創(chuàng)傷小等優(yōu)點(diǎn)成為備受關(guān)注的“液態(tài)活檢”。基于ISET原理,通過前期研究建立了改良ISET檢測CTCs技術(shù)體系,主要工作基礎(chǔ)包括：建立了改良ISET手工實(shí)驗裝置、改良了染色方法、提高了腫瘤細(xì)胞截留率,研究結(jié)果表明該技術(shù)體系檢測效果較為理想,腫瘤細(xì)胞截留率可達(dá)80%以上,染色后的細(xì)胞形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)可辨,能區(qū)分典型的CTCs與正常白細(xì)胞。

聯(lián)合細(xì)胞免疫熒光技術(shù),建立ISET聯(lián)合細(xì)胞免疫熒光檢測循環(huán)腫瘤細(xì)胞技術(shù)體系,并通過檢測23侈Ⅲ/Ⅳ期腫瘤患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行臨床預(yù)研究。通過對課題組前期ISET技術(shù)進(jìn)行優(yōu)化,聯(lián)合細(xì)胞免疫熒光技術(shù),建立了ISET-ICC檢測CTCs技術(shù)體系。通過細(xì)胞蠟塊-免疫組化技術(shù)體系,驗證了ISET-ICC技術(shù)體系分離獲得的CTCs性質(zhì),證實(shí)了EMT的存在。

通過與CellSearch、CTC-Biopsy兩種CTCs檢測方法對比,證實(shí)了ISET-ICC技術(shù)具有臨床應(yīng)用可行性,能夠用于肺癌、食管癌、胃癌、結(jié)直腸癌、腎癌、肝癌患者的CTCs檢測。ISET聯(lián)合細(xì)胞免疫熒光技術(shù)能檢測到上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的循環(huán)腫瘤細(xì)胞以及循環(huán)腫瘤微栓,而這兩種細(xì)胞是造成CellSearch假陰性的主要原因。ISET聯(lián)合細(xì)胞免疫熒光技術(shù)能夠輔助鑒定CTC-Biopsy方法富集的CTCs。

參考文獻(xiàn)

[1]Analysis of Circulating Tumor Cells in Patients with Non-small Cell Lung Cancer Using Epithelial Marker-Dependent and-Independent Approaches[J].Matthew G.Krebs,Jian-Mei Hou,Robert Sloane,Lee Lancashire,Lynsey Priest,Daisuke Nonaka,Tim H.Ward,Alison Backen,Glen Clack,Andrew Hughes,Malcolm Ranson,Fiona H.Blackhall,Caroline Dive.Journal of Thoracic Oncology.2012(2)

[2]Characterization of circulating tumor cell aggregates identified in patients with epithelial tumors[J].Edward H Cho,Marco Wendel,Madelyn Luttgen,Craig Yoshioka,Dena Marrinucci,Daniel Lazar,Ethan Schram,Jorge Nieva,Lyudmila Bazhenova,Alison Morgan,Andrew H Ko,W Michael Korn,Anand Kolatkar,Kelly Bethel,Peter Kuhn.Physical Biology.2012(1)

[3]Morphological analysis of circulating tumour cells in patients undergoing surgery for non‐small cell lung carcinoma using the isolation by size of epithelial tumour cell(ISET)method[J].V.Hofman,E.Long,M.Ilie,C.Bonnetaud,J.M.Vignaud,J.F.Fléjou,S.Lantuejoul,E.Piaton, N.Mourad,C.Butori,E.Selva, C.H.Marquette,M.Poudenx,S.Sibon,S.Kelhef,N.Vénissac,J.P.Jais,J.Mouroux,T.J.Molina,P.Vielh,P.Hofman. Cytopathology.2012(1)

[4]Circulating Tumor Cells as a Window on Metastasis Biology in Lung Cancer[J].Jian-Mei Hou,Matthew Krebs,Tim Ward,Robert Sloane,Lynsey Priest,Andrew Hughes,Glen Clack,Malcolm Ranson,Fiona Blackhall,Caroline Dive.The American Journal of Pathology.2011(3)

[5]Enumeration,characterization,and collection of intact circulating tumor cells by cross contamination‐free flow cytometry[J].MasashiTakao,KazuoTakeda.Cytometry.2011(2)

[6]Epithelial-Mesenchymal Transitions in Development and Disease[J].Jean Paul Thiery,HervéAcloque,Ruby Y.J.Huang,M.Angela Nieto.Cell.2009(5)

[7]E-cadherin,β-catenin,and ZEB1 in malignant progression of cancer[J].Otto Schmalhofer,Simone Brabletz,Thomas Brabletz.Cancer and Metastasis Reviews.2009(1-2)

[8]E-cadherin as an indicator of mesenchymal to epithelial reverting transitions during the metastatic seeding of disseminated carcinomas[J].Alan Wells,Clayton Yates,Christopher R.Shepard.Clinical&Experimental Metastasis.2008(6)

[9]王振丹.ISET聯(lián)合細(xì)胞免疫熒光檢測循環(huán)腫瘤細(xì)胞技術(shù)體系的建立及其臨床研究[D].濟(jì)南大學(xué),2015.