背景[1-4]
Protein A Agarose(Fast Flow,進口分裝)主要用于免疫沉淀(Immunoprecipitation,IP)或免疫共沉淀(Co-IP)，也可以用于抗體的純化。Protein A Agarose適合于免疫沉淀mouse IgG2a,IgG2b,IgA,rabbit IgG,以及human IgG1,IgG2和IgG4。Protein A是最初在細菌金黃色葡萄球菌細胞壁中發(fā)現(xiàn)的42kDa表面蛋白。它由spa基因編碼，其調(diào)節(jié)受DNA拓撲結(jié)構(gòu)，細胞滲透壓和稱為ArlS-ArlR的雙組分系統(tǒng)控制。
由于其結(jié)合免疫球蛋白的能力，它已被發(fā)現(xiàn)用于生物化學研究。它由五個同源的Ig結(jié)合結(jié)構(gòu)域組成，折疊成三螺旋束。每個結(jié)構(gòu)域能夠結(jié)合來自許多哺乳動物物種的蛋白質(zhì)，最值得注意的是IgG。它結(jié)合大多數(shù)免疫球蛋白的Fc區(qū)內(nèi)的重鏈以及內(nèi)部的重鏈在人VH3家族的情況下的Fab區(qū)域。通過血清中的這些相互作用，其中IgG分子以錯誤的方向結(jié)合（與正?？贵w功能相關），細菌破壞調(diào)理作用和吞噬作用。
Protein A在工業(yè)發(fā)酵中產(chǎn)生和純化，用于免疫學，生物學研究和工業(yè)應用。天然（或天然）蛋白A可以在金黃色葡萄球菌中培養(yǎng)，并含有上述五個同源抗體結(jié)合區(qū)和用于細胞壁附著的C-末端區(qū)。今天，蛋白質(zhì)A更常見地在大腸桿菌中重組產(chǎn)生。（Brevibacillus也被證明是一種有效的宿主）蛋白A的重組形式也含有五個同源抗體結(jié)合域，但可能在結(jié)構(gòu)的其他部分有所不同，以促進與多孔底物的偶聯(lián)該蛋白質(zhì)的工程版本也可用，其中個是rProtein A，B4，C-CYS。
工程版本是單個域的多聚體（通常是四聚體，五聚體或六聚體），其經(jīng)過修飾以改善工業(yè)應用中的可用性。Protein A通常與其他分子偶聯(lián)，例如熒光染料，酶，生物素，膠體金或放射性碘，而不影響抗體結(jié)合位點。包括蛋白A-gold（PAG）染色的實例用于免疫金標記，熒光團偶聯(lián)蛋白A用于免疫熒光，DNA對接鏈偶聯(lián)蛋白A用于DNA-PAINT成像。它還廣泛用于磁性，乳膠和瓊脂糖珠。蛋白A通常固定在固體支持物上，并用作從粗蛋白質(zhì)混合物如血清或腹水中純化總IgG的可靠方法，或與上述標記之一偶聯(lián)以檢測抗體的存在。
應用[5][6]
1.用于親和層析法快速分離純化血清IgM
采用Protein A親和層析法對鯽Carassius auratus血清中的IgM進行快速分離純化,所得產(chǎn)物用聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和免疫印跡(Western blotting)進行分析檢測。結(jié)果表明:采用Protein A親和層析法可以很好地分離到高純度的鯽血清IgM,電泳條帶中重鏈和輕鏈清晰可辨,重鏈、輕鏈的相對分子質(zhì)量分別為85 000、25 000左右,無明顯雜帶;利用純化的鯽血清IgM免疫小鼠,獲得了高效價抗IgM抗血清,可以特異性識別鯽血清和黏液中IgM重鏈。
應用間接ELISA方法對浸泡免疫后的鯽血清和皮膚黏液中抗體的動態(tài)進行檢測,結(jié)果顯示:鯽皮膚黏液中的抗體滴度在免疫后第6天達到峰值,血清中抗體滴度在免疫后第15天達到峰值,前者高峰期出現(xiàn)較早,但持續(xù)時間短,后者高峰期出現(xiàn)較晚,但持續(xù)時間較長。
2. 用于反向免疫共沉淀技術純化高活性BTV
以藍舌病毒（Bluetongue virus,BTV）為模型,結(jié)合有限的離心和瓊脂糖蛋白質(zhì)A沉淀目標生物大分子的背景雜質(zhì),達到獲取高純度,高活性生物大分子的目的。該方法與傳統(tǒng)的技術不同,沉淀的不是目標物質(zhì),而是背景雜質(zhì),故命名為瓊脂糖蛋白質(zhì)A反向免疫共沉淀技術（Protein A intermediary reverse co-immunoprecipitation,PARIP）。
反復凍融破碎裂解的未感染病毒的Vero細胞800rpm離心10分鐘后,取上清,制備成抗原,以常規(guī)方法免疫家兔,制備抗Vero細胞碎片和抗小牛血清的多克隆抗體。在一定的溫度、pH值、反應時間和振蕩速度等條件下,利用蛋白質(zhì)A能與IgG抗體非特異性牢固結(jié)合的特點,將免疫家兔所得多克隆抗體耦聯(lián)到瓊脂糖Protein A上;再利用抗體抗原特異性結(jié)合的特點,以此耦聯(lián)了抗體的瓊脂糖Protein A去吸附細胞培養(yǎng)病毒增殖混合懸液（經(jīng)12000rpm,15min離心去沉淀）中的Vero細胞碎片及小牛血清抗原。
發(fā)生上述反應的試管以1000rpm,15min低速離心,可使介質(zhì)瓊脂糖Protein A及其上附著的抗原抗體復合物沉淀下來,上清即為純化的含單一病毒成分的懸液。瓊脂糖雙向免疫擴散檢測純化后的病毒懸液,懸液中不含抗Vero細胞碎片及小牛血清抗原的抗體。介質(zhì)瓊脂糖ProteinA上吸附的抗原抗體復合物可用緩沖液B洗去后繼續(xù)使用。用透射電鏡觀察病毒純化效果,純化后的病毒懸液背景清晰,病毒粒子多且輪廓清楚。
參考文獻
[1]The kinetics of antibody pro-duction in mucus and serum of European eel after vaccination a-gainstVibrio vulnicus:development of a new method for antibodyquantification in skin mucus.Esteve MD,Nielsen ME,Amaro C.Fish&Shellfish Immunol.2003
[2]Monoclonal antibodies against sea bass Dicentrarchus labrax(L.)immunoglobulins:immunolocalisation of immunoglobulin-bearing cells and applicability in immunoassays.Scarpigliati G,Romano N,Picchietti S,et al.Fish and Shellfish Immunology.1996
[3]Production of monoclonalantibodies against serum immunoglobulins of black rockfish(SebastesschlegeliHigendorf).Shin G,Lee H,Palaksha KJ,et al.Journal of Veterinary Science.2006
[4]Characterisation of mucosal and systemic immune responses in rainbow trout(Oncorhynchus mykiss)using surface plasmon resonance.CainKD,,JonesD R,Raison RL.Fjsh Shellfish Immuno1.2000
[5]吳光輝,王慶,鞏華,石存斌,李華,吳淑勤.用Protein A親和層析法快速分離純化鯽血清IgM方法的建立和應用[J].大連海洋大學學報,2010,25(03):233-237.
[6]吳光輝,王慶,鞏華,石存斌,李華,吳淑勤.用Protein A親和層析法快速分離純化鯽血清IgM方法的建立和應用[J].大連海洋大學學報,2010,25(03):233-237.