背景^[1-3]

免疫染色二抗稀釋液是一種用于免疫染色實(shí)驗(yàn)中稀釋二抗的試劑。其主要目的是通過(guò)稀釋抗體來(lái)防止抗體效價(jià)下降，并減少抗體在組織上的非特異性吸附。這種稀釋液通常由TBS（Tris Buffered Saline，三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽溶液）、明膠、BSA（牛血清白蛋白）、防腐劑等成分組成。

使用免疫染色二抗稀釋液時(shí)，需要參考所用的二抗的說(shuō)明書，以及樣品中目的蛋白的含量，按照適當(dāng)?shù)谋壤ㄈ?:1000至1:500）稀釋二抗。稀釋后的二抗可以直接用于非熒光免疫染色實(shí)驗(yàn)。此外，一次免疫染色結(jié)束后，可以回收稀釋的二抗，在4℃保存，以便下次使用。根據(jù)不同的產(chǎn)品說(shuō)明，稀釋后的二抗可以在一定的時(shí)間范圍內(nèi)（如1至2周）重復(fù)使用數(shù)次。

免疫染色二抗稀釋液

免疫染色二抗稀釋液通常用于稀釋熒光或酶標(biāo)記的二抗，以減少非特異性結(jié)合并提高信號(hào)強(qiáng)度。以下是一些建議和注意事項(xiàng)：

選擇適當(dāng)?shù)南♂屢海撼Ｓ玫南♂屢河蠵BS、TBS、Tween-PBS等。選擇哪種取決于您使用的一抗和二抗的特性。

避免過(guò)度稀釋：雖然稀釋可以提高信號(hào)強(qiáng)度，但過(guò)度稀釋可能會(huì)導(dǎo)致信號(hào)太弱或背景噪音增加。建議從較高的濃度開始，然后逐漸稀釋到所需的濃度。

考慮pH值：某些抗體可能對(duì)pH值敏感。在稀釋之前，檢查二抗的說(shuō)明書或與供應(yīng)商聯(lián)系，了解推薦的pH范圍。

避免使用含有疊氮鈉的緩沖液：疊氮鈉是一種常用的防腐劑，但它可能會(huì)與某些熒光染料反應(yīng)，導(dǎo)致信號(hào)減弱或消失。

儲(chǔ)存：一旦稀釋，建議盡快使用。如果需要儲(chǔ)存，應(yīng)將其存放在4°C，并在24小時(shí)內(nèi)使用。避免多次凍融。

檢查非特異性結(jié)合：在正式實(shí)驗(yàn)之前，可以使用沒(méi)有一抗的樣品進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，以檢查二抗的非特異性結(jié)合。

考慮背景噪音：確保您的樣品制備和洗滌步驟足夠嚴(yán)格，以減少背景噪音。

使用對(duì)照：為了確保實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，建議使用適當(dāng)?shù)膶?duì)照，如陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和無(wú)關(guān)抗體對(duì)照。

考慮二抗的濃度：根據(jù)實(shí)驗(yàn)的需要和一抗的濃度，可能需要調(diào)整二抗的濃度。通常，從較低的濃度開始，然后逐漸增加，直到獲得最佳信號(hào)。

避免交叉反應(yīng)：確保您使用的二抗與您的一抗是特異性匹配的。如果可能的話，進(jìn)行交叉反應(yīng)測(cè)試。

應(yīng)用^[4][5]

免疫染色二抗稀釋液可以用于基于Mhp336蛋白的豬肺炎支原體ELISA抗體檢測(cè)方法的建立

豬肺炎支原體ELISA抗體檢測(cè)方法的建立目的:建立較為靈敏的豬肺炎支原體ELISA抗體檢測(cè)方法。

方法:首先確定檢測(cè)方法的最佳反應(yīng)條件,包括抗原包被濃度的確定、封閉液的選擇、封閉時(shí)間的確定、一抗稀釋比例、一抗孵育時(shí)間、免疫染色二抗稀釋液稀釋比例、二抗孵育時(shí)間、顯色時(shí)間和檢測(cè)方法的判定標(biāo)準(zhǔn)。然后進(jìn)行批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)、批間重復(fù)性試驗(yàn)、特異性試驗(yàn)和靈敏性試驗(yàn)。最后用建立的方法對(duì)226份臨床豬血清樣品進(jìn)行檢測(cè),并與本實(shí)驗(yàn)室前期建立的基于Mhp366蛋白的ELISA抗體檢測(cè)試劑盒以及IDEXX公司的Mhp抗體試劑盒進(jìn)行比較。

結(jié)果:確定抗原包被濃度為0.05μg/mL,封閉液為2.5%脫脂奶粉,封閉時(shí)間為1h,一抗稀釋比例為1:500,一抗孵育時(shí)間為0.5 h,免疫染色二抗稀釋液稀釋比例為1:10 000,二抗孵育時(shí)間為1h,顯色時(shí)間為5 min,檢測(cè)方法的臨界值為0.332。批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)和批間重復(fù)性試驗(yàn)的變異系數(shù)均低于7%,特異性和靈敏性良好。226份臨床臨床豬血清樣品的檢測(cè)結(jié)果表明本研究建立的檢測(cè)方法具有較高的靈敏性。結(jié)論:建立了基于Mhp336蛋白的豬肺炎支原體ELISA抗體檢測(cè)方法,該方法具有良好的重復(fù)性,特異性和靈敏性。該方法的靈敏性高于本實(shí)驗(yàn)室前期建立的檢測(cè)方法。

參考文獻(xiàn)

[1]Development of an ELISA for distinguishing convalescent sera with Mycoplasma hyopneumoniae infection from hyperimmune sera responses to bacterin vaccination in pigs.[J].Ding Honglei;Wen Yukang;Xu Zuobo;Zhou Bingqian;Tlili Chaker;Tian Yaqin;Wang Zhaodi;Ning Yaru;Xin Jiuqing.Veterinary medicine and science,2021

[2]Perspectives for improvement of Mycoplasma hyopneumoniae vaccines in pigs[J].Maes Dominiek;Boyen Filip;Devriendt Bert;Kuhnert Peter;Summerfield Artur;Haesebrouck Freddy.Veterinary Research,2021

[3]Pathogenicity&virulence of Mycoplasma hyopneumoniae.[J].Leal Zimmer Fernanda M A;Paes Jéssica Andrade;Zaha Arnaldo;Ferreira Henrique Bunselmeyer.Virulence,2020

[4]Functional Identification and Structural Analysis of a New Lipoate Protein Ligase in Mycoplasma hyopneumoniae.[J].Zhu Kemeng;;Chen Huan;;Jin Jin;;Wang Ning;;Ma Guixing;;Huang Jiandong;;Feng Youjun;;Xin Jiuqing;;Zhang Hongmin;;Liu Henggui.Frontiers in cellular and infection microbiology,2020

[5]董青霜.基于Mhp336蛋白的豬肺炎支原體ELISA抗體檢測(cè)方法的建立[D].西南大學(xué),2024.