背景^[1-3]

Taq DNA聚合酶是第一個被發(fā)現(xiàn)的熱穩(wěn)定DNA聚合酶，最初由Saiki等從溫泉中分離的一株水生噬熱桿菌（thermus aquaticus）中提取獲得。其分子量為65kD，具有多種特性，包括：

1.熱穩(wěn)定性：這是Taq DNA聚合酶最顯著的特點。即使在高溫（如70℃、93℃和95℃）下反應(yīng)數(shù)小時，它仍能保持較高的活性。這種特性使得它在PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）過程中能夠持續(xù)發(fā)揮作用，無需每輪循環(huán)時重新加入新酶。

2.聚合酶活性：Taq DNA聚合酶具有5'→3'聚合酶活性，可以以DNA為模板，以結(jié)合在特定DNA模板上的引物為出發(fā)點，將四種脫氧核苷酸以Watson—Crick配對的方式按5'→3'方向沿模板順序合成新的DNA鏈。

3.核酸外切酶活性：除了聚合酶活性，Taq DNA聚合酶還具有5’→3'核酸外切酶活性，這種活性是依賴于DNA合成的鏈置換的。

4.轉(zhuǎn)錄活性：此外，Taq DNA聚合酶還具有轉(zhuǎn)錄活性。

較弱的非模板依賴性：這意味著它在某些情況下可以在沒有模板的情況下進(jìn)行DNA合成，但這種能力相對較弱。

5.缺乏3'→5'外切酶活性：與某些其他DNA聚合酶不同，Taq DNA聚合酶不具有3'→5'外切酶活性。

Taq DNA聚合酶

Taq DNA聚合酶在多個領(lǐng)域都有廣泛的應(yīng)用，包括基因檢測和分析、藥物研發(fā)、生物學(xué)研究以及生物工程和基因工程等。在PCR技術(shù)中，結(jié)合Taq酶的高靈敏性和特異性，它可用于早期疾病診斷。在基因檢測和分析中，它用于擴(kuò)增和分析特定基因或DNA序列，從而診斷遺傳性疾病、進(jìn)行基因表達(dá)研究、DNA指紋分析等。

Taq DNA聚合酶是一種非常常用的DNA聚合酶，具有耐高溫、高保真性、快速和易于使用等優(yōu)點，廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)研究和臨床診斷等領(lǐng)域。

應(yīng)用^[4][5]

Taq DNA聚合酶可以用于Taq DNA聚合酶的結(jié)構(gòu)修飾與表征

根據(jù)Taq DNA聚合酶的結(jié)構(gòu)與功能信息以及前人對該酶的研究,對Taq DNA聚合酶基因進(jìn)行了結(jié)構(gòu)修飾,并對修飾后的聚合酶活性進(jìn)行了表征,旨在提高酶對抑制劑的耐受程度,使其既可以應(yīng)用于普通PCR體系和實時熒光PCR體系中,也可以應(yīng)用于全血和土壤提取物直接擴(kuò)增的體系。

概述了PaqDNA聚合酶的發(fā)現(xiàn)、性質(zhì)、結(jié)構(gòu)及其在PCR技術(shù)中的應(yīng)用。TaqDNA聚合酶應(yīng)用廣泛,但在臨床應(yīng)用中仍有諸多不足之處。通過對Taq DNA聚合酶進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造或化學(xué)修飾,可以降低或消除酶的5’-3’核酸外切酶活性,提高酶的耐熱性、續(xù)進(jìn)性、忠實性、特異性、對抑制劑的耐受程度以及使酶具有熱啟動活性等。

利用基因工程技術(shù)對Taq DNA聚合酶進(jìn)行改造。首先,通過定點突變對酶的3個氨基酸位點進(jìn)行突變,即E626K、I707L和E708Q。其中E626K和1707L這兩個位點的突變可以提高酶的最適反應(yīng)溫度,減少非特異性產(chǎn)物的擴(kuò)增。E708Q的突變可以顯著提高酶對多種PCR抑制劑的耐受能力。其次,通過缺失突變?nèi)コ嗣窷端的278個氨基酸,以消除酶的5’-3’核酸外切酶活性。在基因突變改造后,我們還對改造后的酶進(jìn)行檸康酸酐修飾,以使其具有熱啟動的效果,從而減少PCR擴(kuò)增中引物二聚體及非特異性產(chǎn)物的擴(kuò)增。

對改造后的酶—KT-C3DNA聚合酶的性質(zhì)進(jìn)行表征。首先,考察該酶的熱穩(wěn)定性和最適反應(yīng)溫度。結(jié)果顯示KT-C3DNA聚合酶具有較高的熱穩(wěn)定性,在95℃加熱4h后還能進(jìn)行正常的PCR擴(kuò)增,它的最適延伸溫度比普通Taq DNA聚合酶提高約4℃,較高的延伸溫度可以有效減少引物二聚體及非特異性產(chǎn)物的擴(kuò)增。其次,考察KT-C3DNA聚合酶在實時PCR體系中的應(yīng)用性能,并與商品Taq DNA聚合酶及具有熱啟動活性的Taq-HS(Takara)作對比。發(fā)現(xiàn)該酶具有與商品酶相當(dāng)?shù)臄U(kuò)增效果和靈敏度。

考察KT-C3DNA聚合酶對乙醇、SDS、NaCl的耐受程度,及在全血和土壤提取物中的擴(kuò)增性能,發(fā)現(xiàn)該酶可以耐受10%的乙醇、0.048%的SDS、100mM的NaCl?？梢栽?5%及以上的全血中進(jìn)行很好的擴(kuò)增,而且在含有5%的全血中還能達(dá)到1×101copies/μL的擴(kuò)增靈敏度,檸康酸酐修飾后的KT-C3DNA聚合酶還能耐受10μL/反應(yīng)的土壤提取物,并且在含有4μL/反應(yīng)的土壤提取物中還能達(dá)到1×100copies/μL的擴(kuò)增靈敏度。說明KT-C3DNA聚合酶對抑制劑的耐受程度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于一般的商品酶。一定程度上降低了PCR反應(yīng)對模板的要求,擴(kuò)大了PCR技術(shù)的應(yīng)用范圍。對促進(jìn)DNA聚合酶的發(fā)展和PCR技術(shù)在分子診斷技術(shù)上的應(yīng)用都具有重要意義。

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