背景[1-3]
RIPA裂解液即放射免疫沉淀法裂解緩沖液，是一種傳統(tǒng)的可用于裂解細(xì)胞或組織的快速裂解液。其主要原理是利用表面活性劑等成分裂解細(xì)胞膜（包括核膜），從組織或細(xì)胞中抽取可溶性蛋白。
RIPA裂解液主要用于從動(dòng)物組織和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中抽取可溶性蛋白，可適用于裂解貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞。其裂解后得到的蛋白一般可直接用于常規(guī)的WB（Western Blot，蛋白質(zhì)印跡法）、IP（免疫沉淀）以及co-IP（免疫共沉淀）等實(shí)驗(yàn)。
RIPA裂解液的配制方法多樣，主要包括裂解成分、蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑三種組分。裂解成分能破壞細(xì)胞膜和蛋白間的相互作用，從而裂解組織或細(xì)胞；蛋白酶抑制劑可有效抑制各類蛋白酶的活性，防止蛋白過度降解；磷酸酶抑制劑則能抑制去磷酸化作。
RIPA裂解液
在使用RIPA裂解液時(shí)，為防止蛋白降解，所有的操作應(yīng)盡量在冰上進(jìn)行。同時(shí)，建議向溶液中加入蛋白酶抑制劑或磷酸酶抑制劑。此外，根據(jù)具體的實(shí)驗(yàn)需求，若需獲得更高濃度的蛋白，應(yīng)適當(dāng)減少哺乳動(dòng)物蛋白抽提試劑的使用量。
值得注意的是，由于RIPA裂解液中含有一些穩(wěn)定性相對(duì)較弱的酶類抑制劑，如PMSF，其穩(wěn)定性極弱，半衰期只有0.5小時(shí)，因此必須現(xiàn)配現(xiàn)用，且通常應(yīng)保存在-20℃的環(huán)境中。
RIPA裂解液是一種強(qiáng)大的實(shí)驗(yàn)工具，用于提取和分析細(xì)胞和組織中的蛋白。但請(qǐng)注意，其僅可用于科研實(shí)驗(yàn)，嚴(yán)禁用于其他非科研用途。同時(shí)，為確保實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和可靠性，請(qǐng)嚴(yán)格遵循相關(guān)操作規(guī)程和安全要求。
應(yīng)用[4][5]
RIPA裂解液可以用于IL-37d通過抑制可溶性ST2的表達(dá)維持白色脂肪組織中的免疫穩(wěn)態(tài)、控制肥胖
研究中發(fā)現(xiàn)IL-37d在人脂肪組織和脂肪組織衍生的干細(xì)胞(ADSC)中的特異性表達(dá);IL-37d轉(zhuǎn)基因小鼠抵抗高脂誘導(dǎo)的肥胖及提高胰島素敏感性;機(jī)制探索初步發(fā)現(xiàn)IL-37d可抵抗高脂導(dǎo)致的WAT中ST2+細(xì)胞的降低,提示IL-37d可能通過上調(diào)IL-33/ST2介導(dǎo)的Ⅱ型免疫反應(yīng),維持脂肪的免疫平衡控制肥胖。
利用IL-37d轉(zhuǎn)基因小鼠、IL-37d&IL-33ko基因小鼠,建立高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖模型,進(jìn)一步確定:一、IL-37d通過調(diào)控IL-33/ST2促進(jìn)小鼠脂肪組織Ⅱ型免疫反應(yīng);二、IL-37d調(diào)控IL-33/ST2的分子機(jī)制。
研究方法1.構(gòu)建IL-37d&IL-33ko基因小鼠由公司制作的IL-37d轉(zhuǎn)基因小鼠與IL-33ko基因敲除鼠進(jìn)行雜交,通過PCR與DNA瓊脂糖電泳結(jié)合基因測(cè)序驗(yàn)證得到IL-37d&IL-33ko基因小鼠。
2.IL-37d對(duì)高脂誘導(dǎo)的可溶性ST2的抑制取高脂誘導(dǎo)的WT或IL-37d轉(zhuǎn)基因小鼠的皮下脂肪與附睪脂肪組織,用Trizol試劑提取脂肪組織RNA,用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為DNA,用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)可溶性ST2的mRNA水平;將皮下脂肪與附睪脂肪組織體外培養(yǎng)24小時(shí)取培養(yǎng)上清用ELISA法檢測(cè)上清中可溶性ST2的含量。
3.IL-37d對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的可溶性ST2的抑制取WT或IL-37d轉(zhuǎn)基因鼠來源的皮下脂肪,提取皮下脂肪組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(S-ADSC),使用TNF-α(1Ong/ml)或PBS對(duì)照刺激24小時(shí),提取細(xì)胞總RNA,用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為DNA,用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)可溶性ST2的mRNA水平;取細(xì)胞培養(yǎng)上清,用ELISA法檢測(cè)上清中可溶性ST2的含量。
4.IL-37d對(duì)通過抑制NF-κB途徑抑制可溶性ST2取高脂誘導(dǎo)的WT或IL-37d轉(zhuǎn)基因小鼠的皮下脂肪與附睪脂肪組織,用Trizol試劑及RIPA裂解液提取脂肪組織RNA,用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為DNA,用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)NF-κB途徑調(diào)控的IL-6,IL-1β和TNF-α的mRNA水平;用RIPA裂解液將皮下脂肪與附睪脂肪組織裂解,高速離心后提取蛋白,用western blot檢測(cè)P65磷酸化水平。
5.IL-37d對(duì)通過與受體IL-1R8結(jié)合抑制NF-κB途徑取IL-37d轉(zhuǎn)基因小鼠的皮下脂肪,提取皮下脂肪組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(S-ADSC),用小干擾RNA干擾IL-1R8,使用TNF-α(1Ong/ml)或PBS對(duì)照刺激24小時(shí),提取細(xì)胞總RNA,用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為DNA,用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)可溶性ST2的mRNA水平;用RIPA裂解液將皮下脂肪與附睪脂肪組織裂解,高速離心后提取蛋白,用western blot檢測(cè)P65磷酸化水平。
結(jié)果：用RIPA裂解液將皮下脂肪與附睪脂肪組織裂解,高速離心后提取蛋白,用western blot檢測(cè)P65磷酸化水平,發(fā)現(xiàn)高脂顯著增加P65磷酸化水平,而IL-37d轉(zhuǎn)基因小鼠的脂肪組織P65磷酸化水平低于野生型小鼠,以上結(jié)果證明IL-37d可抑制NF-κB途徑,進(jìn)而抑制sST2。5.IL-37d對(duì)通過與受體IL-1R8結(jié)合抑制NF-κB途徑取IL-37d轉(zhuǎn)基因小鼠的皮下脂肪,提取皮下脂肪組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(S-ADSC),用小干擾RNA干擾IL-1R8,使用TNF-α(1Ong/ml)或PBS對(duì)照刺激24小時(shí),提取細(xì)胞總RNA,用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為DNA,用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)sST2的mRNA水平,發(fā)現(xiàn)干擾IL-1R8可以逆轉(zhuǎn)IL-37d對(duì)sST2的抑制;用RIPA裂解液將皮下脂肪與附睪脂肪組織裂解,高速離心后提取蛋白,用western blot檢測(cè)P65磷酸化水平,發(fā)現(xiàn)干擾IL-1R8同樣逆轉(zhuǎn)了IL-37d對(duì)P65磷酸化水平的抑制。
參考文獻(xiàn)
[1]Adipose Tissue-Resident Immune Cells in Obesity and Type 2 Diabetes.[J].Lu Jingli;;Zhao Junjie;;Meng Haiyang;;Zhang Xiaojian.Frontiers in immunology,2019
[2]Pro-inflammatory cytokines:the link between obesity and osteoarthritis[J].Tiantian Wang;;Chengqi He.Cytokine and Growth Factor Reviews,2018
[3]An Integrated View of Immunometabolism[J].Yun Sok Lee;;Joshua Wollam;;Jerrold M.Olefsky.Cell,2018
[4]Suppression of inflammation and acquired immunity by IL-37.[J].Cavalli Giulio;;Dinarello Charles A.Immunological reviews,2018
[5]李超澤.IL-37d通過抑制可溶性ST2的表達(dá)維持白色脂肪組織中的免疫穩(wěn)態(tài)、控制肥胖[D].山東大學(xué),2021.