背景[1-3]
SP6核糖核酸聚合酶也被稱為SP6 RNA聚合酶，是一種由大腸桿菌中的噬菌體SP6產生的酶。這種酶具有在體外合成RNA分子的能力，因此，它常被用于體外轉錄實驗，廣泛應用于合成特定的RNA分子。
SP6核糖核酸聚合酶的主要特點是能夠高度特異識別SP6啟動子序列，是一種DNA依賴的5'→3'RNA聚合酶。它催化單鏈或雙鏈DNA SP6啟動子下游NTP的摻入，合成與SP6啟動子下游的模板DNA互補的RNA。此外，SP6 RNA聚合酶還能識別修飾的NTP，例如生物素標記、熒光素標記的NTP，這使得它在各種標記RNA的合成中具有應用價值。
SP6核糖核酸聚合酶
在科研實驗中，利用SP6核糖核酸聚合酶合成的RNA有多種應用，如制備雜交探針、進行基因組DNA序列分析、核糖核酸酶保護測定、反義RNA合成、作為體外翻譯的RNA模板、RNA剪接研究的底物、RNA二級結構和RNA-蛋白質相互作用研究，以及核酸擴增分析等。此外，它還可以用于合成siRNA、miRNA等小RNA。
值得注意的是，使用SP6核糖核酸聚合酶時，必須以SP6 DNA或克隆在SP6啟動子下游的DNA作為合成模板，并且該酶需要在特定的條件下儲存，一般是-20°C。
應用[4-5]
SP6核糖核酸聚合酶可以用于FasL基因的克隆化及其mRNA在肺癌組織中的表達分布
通過采用反轉錄多聚酶鏈反應(RT-PCR)技術和分子克隆技術克隆人FasL基因片段，制備互補核糖核酸(cRNA)探針，采用原位雜交的方法觀察FasL mRNA在肺癌組織細胞中的表達分布情況，并探討其臨床意義。
方法：分離健康人外周血單核細胞(PBMC)，終濃度為50mM，用植物血凝素-P(PHA-P)激活15分鐘，誘導FasL基因表達，用人全血總RNA提取試劑盒(QIAamp RNA Blood Mini kit)提取總RNA，特異性引物反轉錄制備互補脫氧核糖核酸(cDNA)，聚合酶鏈反應擴增FasL基因片段，產物經瓊脂糖凝膠電泳，顯示在≈328bp處呈現(xiàn)1條與預期產物分子量大小相符的DNA擴增條帶，按照QIAquick凝膠提取試劑盒說明進行膠上PCR產物回收，予以擴增、純化，用PstI、EcoRI雙酶切PCR產物和質粒pSPT19，使PCR產物和質粒DNA兩端互補，用T4連接酶將其定向克隆入質粒中，轉化感受態(tài)大腸桿菌JM109，在涂抹有氨芐青霉素的LB平板上進行藍白篩選，獲取有重組質粒的陽性轉化子，插入的FasL cDNA經DAN測序證實與Genebank中FasL序列相同，用PstI酶酶切重組質粒，使之線性化，經SP6核糖核酸聚合酶體外轉錄制備地高辛標記的FasL cRNA探針(Dig-FasL cRNA)。收集青島大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院胸外科手術切除的肺癌新鮮標本(經病理證實，其中鱗狀細胞癌3例，腺癌2例，小細胞癌1例)，置于無菌Ep管中，經液氮速凍運輸，轉移至-70℃冰箱中備用，標本經4％多聚甲醛和15％蔗糖處理后制備成冰凍切片，厚度為6μm，再經多聚甲醛后固定，非離子型去污劑處理細胞膜，在切片上用cRNA探針進行原位雜交，經四唑氮藍(NBT／BCIP)顯色，鏡下觀察FasLmRNA在肺癌細胞中的表達分布情況。結果：DNA測序證實重組質粒中插入的FasL cDNA序列準確無誤；地高辛標記的FasL cRNA探針經標記效率檢測，標記效率滿意；鏡下觀察發(fā)現(xiàn)三種病理類型的肺癌細胞胞漿中均可檢測到藍紫色雜交信號，表明肺癌細胞中存在FasL mRNA的表達。結論:FasL基因的克隆化成為肺癌細胞凋亡研究的工具;地高辛標記的FasL mRNA探針為進一步研究FasL mRNA在肺癌細胞中的表達分布提供了有效手段:FasL作為促細胞凋亡基因與肺癌的發(fā)生、發(fā)展有重要關系。
參考文獻
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