背景^[1-3]

RIPA裂解液（弱）是一種采用溫和裂解方法從細(xì)胞中提取總蛋白的試劑。它的主要成分包括Tris、NP-40、sodium deoxycholate等，并含有多種蛋白酶抑制劑成分，可以有效抑制蛋白的降解，并維持原有的蛋白間相互作用。

RIPA裂解液（弱）主要用于細(xì)胞的裂解，以釋放細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)。通過裂解過程，可以獲得細(xì)胞內(nèi)的總蛋白，這些蛋白可以用于后續(xù)的PAGE電泳、Western Blot、免疫沉淀（IP）和免疫共沉淀（co-IP）等實(shí)驗(yàn)。這些實(shí)驗(yàn)是分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)中常用的研究方法，可以幫助研究人員了解細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)組成、相互作用以及功能。

使用RIPA裂解液（弱）時(shí)，需要注意其保存條件和使用方法。一般來說，RIPA裂解液（弱）應(yīng)保存在-20℃下，避免反復(fù)凍融，以確保其穩(wěn)定性和有效性。在使用前，可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要適當(dāng)分裝，并加入自備的PMSF等蛋白酶抑制劑。

此外，用RIPA裂解液裂解得到的蛋白樣品，可以使用特定的蛋白濃度測(cè)定試劑盒（如BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒）來測(cè)定蛋白濃度。但需要注意的是，由于RIPA裂解液中含有較高濃度的去垢劑，因此不能使用Bradford法來測(cè)定其裂解得到的蛋白樣品的濃度。

RIPA裂解液（弱）

RIPA裂解液（弱）的步驟如下：

1.樣品前處理：

對(duì)于貼壁細(xì)胞：去除培養(yǎng)液，用PBS、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞。按照細(xì)胞量加入適量RIPA裂解液（弱）。用移液器吹打數(shù)次，使裂解液和細(xì)胞充分接觸。

對(duì)于組織樣品：首先稱重組織，并用PBS洗去血污。然后，將洗凈的組織轉(zhuǎn)移到干凈的EP管中，剪碎。根據(jù)組織重量加入適量RIPA裂解液（弱）。

2.研磨與裂解：

將含有組織的裂解液轉(zhuǎn)移到勻漿器中，進(jìn)行充分研磨至無明顯組織塊。整個(gè)研磨過程需在冰上進(jìn)行。

將勻漿器放在冰上裂解一段時(shí)間（如30分鐘），期間需重復(fù)研磨幾次至裂解液變得清澈。

3.離心與取上清：

使用移液器將裂解液轉(zhuǎn)移到新的EP管中，并在離心機(jī)中進(jìn)行離心（如4°C，16000g離心10分鐘）。

離心后，小心吸取上清液，避免吸到沉淀。

4.保存與變性：

將上清液轉(zhuǎn)移到無菌的EP管中，加入適量loading buffer并混勻。

在95°C下加熱變性一段時(shí)間（如10分鐘），完成后將樣品保存在-20°C冰箱中。

應(yīng)用^[4-5]

RIPA裂解液（弱）可以用于不同種屬動(dòng)物紅細(xì)胞膜大豆凝集素特異性結(jié)合蛋白的分離與鑒定

大豆凝集素(Soybean agglutinin,SBA)是大豆中含量較高的一類具有多種生物活性的蛋白質(zhì),主要通過與細(xì)胞直接或間接的接觸而發(fā)揮自身特有的生物學(xué)功能,其中一個(gè)最基本的生物學(xué)功能就是能夠凝集一些動(dòng)物的紅細(xì)胞。已有研究表明,不同種屬動(dòng)物的紅細(xì)胞對(duì)SBA的敏感程度不同,但具體機(jī)制尚不明確。本試驗(yàn)選擇種屬特征明顯的奶牛、豬、兔的紅細(xì)胞作為試驗(yàn)材料,研究不同動(dòng)物的紅細(xì)胞膜上與SBA特異結(jié)合蛋白種類的異同。試驗(yàn)1:采用低滲溶血法提取牛的紅細(xì)胞膜,分別用NP-40裂解液、RIPA裂解液(中)和RIPA裂解液(弱)作用于牛紅細(xì)胞膜,結(jié)果顯示:NP-40裂解液裂解紅細(xì)胞膜蛋白的效果優(yōu)于RIPA裂解液(中)和RIPA裂解液(弱)。比較奶牛、豬和兔的紅細(xì)胞膜蛋白SDS-PAGE電泳圖可發(fā)現(xiàn),三種動(dòng)物紅細(xì)胞的膜蛋白組成具有相似性,大部分蛋白分布在25 kDa-250 kDa之間,且高分子量的蛋白占的比例明顯高于低分子量的蛋白。同時(shí)它們間也存在一定的差異性:奶牛紅細(xì)胞膜蛋白最為豐富,兔紅細(xì)胞膜蛋白在180 kDa和45 kDa的蛋白豐富度不如奶牛和豬,而豬紅細(xì)胞膜在35 kDa處的蛋白豐富度又不如牛和兔。試驗(yàn)2:通過免疫共沉淀(Co-IP)方法得到紅細(xì)胞膜SBA特異結(jié)合蛋白,再用液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜(LC-MS/MS)聯(lián)用的方法對(duì)這些蛋白進(jìn)行鑒定,通過MASCOT(版本號(hào):2.3.0)軟件搜庫,奶牛評(píng)分大于24分、豬評(píng)分大于23分、兔評(píng)分大于22分的蛋白均為陽性結(jié)果。按照蛋白功能可將質(zhì)譜得到的不同種屬動(dòng)物膜蛋白分為三類:第一類為細(xì)胞膜骨架蛋白,第二類為催化酶類蛋白,第三類為功能調(diào)節(jié)蛋白。其中三種動(dòng)物的骨架蛋白種類均高于催化酶類和功能調(diào)節(jié)類蛋白,且評(píng)分普遍較高;在不同動(dòng)物中也檢測(cè)到了相同的蛋白,但大部分蛋白存在種屬差異。研究結(jié)果為揭示不同種屬動(dòng)物紅細(xì)胞對(duì)SBA敏感程度差異的機(jī)制提供了重要的試驗(yàn)依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

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