背景^[1-3]

RAW 264.7（小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞）是一種源自小鼠的白血病細(xì)胞系，常用于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究。這種細(xì)胞系是從患有單核細(xì)胞白血病的雄性小鼠的脾臟中分離出來的，并經(jīng)過連續(xù)傳代培養(yǎng)而形成的。RAW 264.7細(xì)胞具有巨噬細(xì)胞的特性，如吞噬作用、抗原提呈和產(chǎn)生細(xì)胞因子等。

由于RAW 264.7（小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞）細(xì)胞易于培養(yǎng)和操作，且表現(xiàn)出與原發(fā)性巨噬細(xì)胞相似的功能，因此被廣泛用作研究巨噬細(xì)胞功能和生物學(xué)特性的模型。這些細(xì)胞常被用于研究炎癥、感染、免疫應(yīng)答、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、藥物篩選等領(lǐng)域。

在細(xì)胞培養(yǎng)方面，RAW 264.7（小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞）細(xì)胞通常需要在含有DMEM（杜氏改良Eagle培養(yǎng)基）或RPMI 1640培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，同時添加10%的胎牛血清（FBS）和1%的抗生素-抗真菌混合物以維持細(xì)胞生長并防止污染。這些細(xì)胞通常在37°C、5%CO2的濕潤環(huán)境中生長。

RAW 264.7（小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞）細(xì)胞還可以用于研究各種刺激物（如細(xì)菌、病毒、寄生蟲、細(xì)胞因子等）對巨噬細(xì)胞的影響，以及巨噬細(xì)胞在免疫反應(yīng)中的作用。此外，這些細(xì)胞也被廣泛用于藥物篩選和毒理學(xué)研究，以評估藥物對巨噬細(xì)胞功能和生存能力的影響。

RAW 264.7（小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞）

RAW 264.7（小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞）培養(yǎng)操作

1)復(fù)蘇RAW 264.7（小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞）：以下細(xì)胞培養(yǎng)凍存處理僅供參考，具體操作步驟以隨貨產(chǎn)品說明書為主。

將含有1 mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000 rpm條件下離心3 min，棄去上清液，加1-2 mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入含適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入10 cm皿中，加入約8 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

2)RAW 264.7（小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞）傳代：如果細(xì)胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。

a、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次。

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，使消化液浸潤所有細(xì)胞，棄去消化液，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1 min，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

c、按6-8 mL/瓶補加培養(yǎng)基，輕輕打勻后裝入無菌離心管中，1000 rpm離心4 min，棄去上清液，補加1-2 mL培養(yǎng)液后吹勻。

d、將細(xì)胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

3)RAW 264.7（小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞）凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時，可進行細(xì)胞凍存。下面T25瓶為例；

a、收集細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液，裝入無菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進行細(xì)胞計數(shù)。

b、根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入無血清細(xì)胞凍存液，使細(xì)胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細(xì)胞懸液，注意凍存管做好標(biāo)識。

c、將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉(zhuǎn)入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。

應(yīng)用^[4-5]

RAW 264.7（小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞）可以用于釀酒酵母β-葡聚糖對RAW264.7細(xì)胞氧化應(yīng)激、炎癥和凋亡的緩解作用及機制

利用LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞建立氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)模型,初步證實釀酒酵母β-葡聚糖的抗氧化作用。然后,在氧化應(yīng)激模型基礎(chǔ)上,探究釀酒酵母β-葡聚糖對RAW 264.7（小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞）細(xì)胞抗氧化、抗炎及抗凋亡的分子作用機制,為預(yù)防和治療氧化應(yīng)激相關(guān)性疾病提供新的思路。本研究主要從細(xì)胞信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)方面對釀酒酵母β-葡聚糖抗氧化、抗炎和抗凋亡作用機制進行研究。

結(jié)果如下:(1)試驗一以LPS為誘導(dǎo)物,氧化應(yīng)激和促炎細(xì)胞因子作為建立氧化應(yīng)激和炎癥模型指標(biāo),探究LPS對RAW 264.7（小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞）細(xì)胞氧化損傷效果。結(jié)果表明:0.1～5μg/m L LPS處理RAW 264.7（小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞）細(xì)胞12 h后,細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激指標(biāo)MDA和ROS產(chǎn)生顯著增多,抗氧化指標(biāo)SOD、CAT和GSH-Px酶活性顯著降低;細(xì)胞培養(yǎng)上清液中促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α釋放顯著增多,細(xì)胞內(nèi)COX-2和i NOS含量顯著升高。綜合多項指標(biāo),以1μg/m L LPS作為建立細(xì)胞氧化應(yīng)激和炎癥模型的最佳濃度。

(2)試驗二在試驗一基礎(chǔ)上,初步探討釀酒酵母β-葡聚糖對LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7（小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞）細(xì)胞氧化應(yīng)激和炎癥損傷的緩解作用。

結(jié)果表明:釀酒酵母β-葡聚糖增強抗氧化酶SOD、CAT、GSH-Px和HO活性,抑制LPS誘導(dǎo)的MDA和ROS產(chǎn)生而發(fā)揮抗氧化作用,降低IL-1β、IL-6和TNF-α的釋放以及COX-2和i NOS水平而起到抗炎效果,推測可能是釀酒酵母β-葡聚糖激活抗氧化轉(zhuǎn)錄因子從而發(fā)揮預(yù)保護作用。這些結(jié)果充分說明β-葡聚糖具有抗氧化和抗炎的雙重調(diào)節(jié)作用,從而抑制細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生,進而對RAW 264.7（小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞）細(xì)胞起到保護作用。但其調(diào)控抗氧化和抗炎信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制仍需在氧化應(yīng)激模型中進一步驗證。

(3)試驗三以試驗二為基礎(chǔ)進行深入性研究,本試驗旨在探討β-葡聚糖抑制LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7（小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞）細(xì)胞氧化應(yīng)激分子機制。為闡明β-葡聚糖抗氧化的分子機制,我們設(shè)計了β-葡聚糖添加試驗,結(jié)果表明:β-葡聚糖能夠激活其受體Dectin-1介導(dǎo)的Nrf2/HO-1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。氧化應(yīng)激模型中,在LPS抑制Nrf2和HO-1表達的條件下,β-葡聚糖能顯著上調(diào)LPS誘導(dǎo)的Dectin-1、Nrf2和HO-1的表達,抑制ROS產(chǎn)生,但β-葡聚糖這些作用可被Dectin-1抑制劑Laminarin、Nrf2抑制劑ML385和HO-1抑制劑Sn PP逆轉(zhuǎn)。該結(jié)果表明β-葡聚糖可以通過Dectin-1/Nrf2/HO-1信號通路抑制LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7（小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞）細(xì)胞氧化應(yīng)激。

參考文獻

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