背景^[1-3]

RH-35大鼠肝癌細(xì)胞是一種常用的實(shí)驗(yàn)細(xì)胞系，來(lái)源于大鼠的肝癌組織。這種細(xì)胞系在科學(xué)研究中有廣泛的應(yīng)用，尤其是在肝癌發(fā)病機(jī)制和藥物篩選方面。

RH-35大鼠肝癌細(xì)胞的形態(tài)特征包括貼壁生長(zhǎng)、上皮細(xì)胞樣外觀和大小不均一等。這些細(xì)胞通常呈現(xiàn)多角形或不規(guī)則形狀，有時(shí)會(huì)有突起。在培養(yǎng)條件下，RH-35大鼠肝癌細(xì)胞需要使用適合的培養(yǎng)基，如DMEM、F-12等，并添加適量的生長(zhǎng)因子和血清來(lái)維持其生長(zhǎng)狀態(tài)。

為了保持RH-35大鼠肝癌細(xì)胞的正常生長(zhǎng)和特性，需要注意以下幾點(diǎn)：

培養(yǎng)基和添加劑的質(zhì)量：應(yīng)選擇高質(zhì)量的培養(yǎng)基和添加劑，避免使用過(guò)期或劣質(zhì)的試劑。

溫度和氣體控制：RH-35大鼠肝癌細(xì)胞需要在適宜的溫度和氣體條件下培養(yǎng)，通常為37℃和95%空氣（細(xì)胞代謝必需的）。

傳代和凍存：當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)到一定密度時(shí)，需要進(jìn)行傳代或凍存以維持細(xì)胞系的狀態(tài)。傳代時(shí)應(yīng)使用適量的胰蛋白酶或膠原酶進(jìn)行消化，并控制好濃度和作用時(shí)間。凍存時(shí)應(yīng)選擇適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)劑，如二甲基亞砜（DMSO）等，并控制好冷凍速率和復(fù)溫速率。

微生物污染：應(yīng)定期檢查培養(yǎng)的細(xì)胞是否受到微生物污染，如有疑慮應(yīng)及時(shí)處理。

細(xì)胞鑒別：在使用RH-35大鼠肝癌細(xì)胞時(shí)，應(yīng)進(jìn)行細(xì)胞鑒別，以確保細(xì)胞的特性和純度。

RH-35大鼠肝癌細(xì)胞

RH-35大鼠肝癌細(xì)胞培養(yǎng)操作

1)復(fù)蘇RH-35大鼠肝癌細(xì)胞：以下細(xì)胞培養(yǎng)凍存處理僅供參考，具體操作步驟以隨貨產(chǎn)品說(shuō)明書為主。

將含有1 mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000 rpm條件下離心3 min，棄去上清液，加1-2 mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入含適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過(guò)夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入10 cm皿中，加入約8 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)過(guò)夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

2)RH-35大鼠肝癌細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

a、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次。

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，使消化液浸潤(rùn)所有細(xì)胞，棄去消化液，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1 min，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

c、按6-8 mL/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后裝入無(wú)菌離心管中，1000 rpm離心4 min，棄去上清液，補(bǔ)加1-2 mL培養(yǎng)液后吹勻。

d、將細(xì)胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

3)RH-35大鼠肝癌細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。下面T25瓶為例；

a、收集細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液，裝入無(wú)菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

b、根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入無(wú)血清細(xì)胞凍存液，使細(xì)胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細(xì)胞懸液，注意凍存管做好標(biāo)識(shí)。

c、將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉(zhuǎn)入液氮灌儲(chǔ)存。記錄凍存管位置以便下次拿取。

應(yīng)用^[4-5]

RH-35大鼠肝癌細(xì)胞可以用于SPINK1調(diào)節(jié)大鼠正常肝細(xì)胞BRL-3A和大鼠肝癌細(xì)胞RH-35增殖的分子機(jī)理及其比較分析

通過(guò)免疫共沉淀(immunoprecipitation assay,IP)的方法也發(fā)現(xiàn)SPINK1能夠與EGFR相結(jié)合。最近的研究表明EGFR被生長(zhǎng)因子等激活后,能夠通過(guò)p38MAPK、ERK、JNK、PKC、JAK-STAT和AKT等多條信號(hào)通路促進(jìn)細(xì)胞的增殖。本文通過(guò)IPA(Ingenuity Pathway Analysis 9.0)軟件,結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)分析SPINK1與EGFR信號(hào)通路的互作網(wǎng)絡(luò),發(fā)現(xiàn)SPINK1可能與EGFR結(jié)合后通過(guò)上述6條信號(hào)通路調(diào)控細(xì)胞的增殖。

為探究SPINK1調(diào)控肝細(xì)胞和肝癌細(xì)胞增殖的機(jī)理,本文通過(guò)基因添加的方法處理BRL-3A細(xì)胞,并用重組蛋白處理BRL-3A細(xì)胞和RH-35大鼠肝癌細(xì)胞,通過(guò)MTT、EdU、流式細(xì)胞術(shù)等方法檢測(cè)SPINK1上調(diào)表達(dá)對(duì)上述兩種細(xì)胞活力、增殖和周期等的影響,通過(guò)免疫共沉淀、qRT-PCR和western blot等方法推測(cè)SPINK1調(diào)控兩種細(xì)胞增殖的機(jī)理。

結(jié)果表明,通過(guò)基因添加的方法上調(diào)BRL-3A細(xì)胞內(nèi)源性Spink1的表達(dá)后,細(xì)胞的生長(zhǎng)活力和增殖,S期和G2/M期的細(xì)胞數(shù)量,細(xì)胞增殖和抗凋亡相關(guān)基因/蛋白的表達(dá)都明顯增加,然而,G1期的細(xì)胞數(shù)量和促凋亡相關(guān)基因/蛋白的表達(dá)都明顯減少。通過(guò)qRT-PCR和western blot等方法檢測(cè)SPINK1信號(hào)通路相關(guān)基因/蛋白的變化,發(fā)現(xiàn)p38,ERK和JNK信號(hào)通路相關(guān)基因/蛋白的表達(dá)發(fā)生顯著的變化。當(dāng)用外源性的重組大鼠SPINK1蛋白(rat recombinant SPINK1,rrSPINK1)處理BRL-3A細(xì)胞時(shí),所得到的結(jié)果與上述結(jié)果相似。

當(dāng)用rrSPINK1處理RH-35大鼠肝癌細(xì)胞時(shí),我們發(fā)現(xiàn)與處理BRL-3A細(xì)胞所得到的結(jié)果相似,RH-35大鼠肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)活力和增殖,S期和G2/M期的細(xì)胞數(shù)量,細(xì)胞增殖和抗凋亡相關(guān)基因/蛋白的表達(dá)都明顯提高,G1期的細(xì)胞數(shù)量和凋亡相關(guān)基因/蛋白的表達(dá)都明顯減少。qRT-PCR和western blot檢測(cè)結(jié)果表明,在RH-35大鼠肝癌細(xì)胞中,p38和JAK-STAT3信號(hào)通路相關(guān)基因/蛋白的表達(dá)發(fā)生顯著的變化。本文用pEGFR抗體處理穩(wěn)定表達(dá)內(nèi)源性Spink1的陽(yáng)性單克隆BRL-3A細(xì)胞發(fā)現(xiàn),該細(xì)胞的生長(zhǎng)活力受到明顯的抑制,并且抑制效果隨著抗體劑量的增加愈加明顯,進(jìn)一步驗(yàn)證了SPINK1與EGFR結(jié)合后發(fā)揮其相應(yīng)的功能。

綜上所述,SPINK1與EGFR結(jié)合后通過(guò)p38、ERK和JNK等3條信號(hào)通路調(diào)控細(xì)胞增殖相關(guān)基因/蛋白MYC和CCND1和凋亡相關(guān)基因/蛋白BAX,CASPASE3的表達(dá),促進(jìn)BRL-3A細(xì)胞的增殖;通過(guò)p38和JAK-STAT3等2條信號(hào)通路調(diào)控細(xì)胞增殖相關(guān)基因/蛋白MYC和CCND1和凋亡相關(guān)基因/蛋白CASPASE3的表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)RH-35大鼠肝癌細(xì)胞的增殖。

參考文獻(xiàn)

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