背景及概述[1]
miRNA是一類由內(nèi)源基因編碼的長(zhǎng)度為20~24個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，其在體內(nèi)參與轉(zhuǎn)錄后基因的表達(dá)調(diào)控。從發(fā)現(xiàn)至今已經(jīng)有1000余種miRNA在人類中鑒定出來。miRNA首先由RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄成長(zhǎng)達(dá)數(shù)百個(gè)或數(shù)千個(gè)堿基大小的初始轉(zhuǎn)錄子(pri-miRNAs)。初始轉(zhuǎn)錄子被含有Drosha(核酸內(nèi)切酶III)和雙鏈RNA結(jié)合蛋白Pasha的復(fù)合物剪切為60~70個(gè)的miRNA前體(pre-miRNA)。miRNA前體由小分子單體G蛋白R(shí)an-GTP依賴的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白exportin-5運(yùn)輸至細(xì)胞質(zhì)，被Dicer酶(核酸內(nèi)切酶)剪切成約22個(gè)核苷酸的雙鏈miRNA。雙鏈miRNA被解旋酶解螺旋后，1條鏈被降解，另1條成為5′端為磷酸基團(tuán)、3′端為羥基的成熟miRNA。miRNA雖不編碼蛋白，但通過對(duì)特定mRNA的降解或沉默來實(shí)現(xiàn)對(duì)特定基因的調(diào)控。計(jì)算證明，miRNA在一般情況下可以調(diào)控上百個(gè)基因。然而，每種miRNA在不同環(huán)境中的特定功能仍不清楚。
miRNA海綿是一條人為改造的mRNA，其3’非翻譯區(qū)(UTR)包含若干個(gè)在RISC切割位點(diǎn)有幾個(gè)錯(cuò)配的miRNA靶位點(diǎn)，導(dǎo)致此mRNA在吸附miRNA的同時(shí)不會(huì)被降解，讓miRNA遠(yuǎn)離其天然的mRNA靶點(diǎn)從而功能出現(xiàn)缺失。作為mRNA，它需由質(zhì)粒(病毒)載體通過轉(zhuǎn)(感)染進(jìn)入細(xì)胞后介導(dǎo)其在細(xì)胞中的表達(dá)。相較于化學(xué)合成類抑制劑，miRNA海綿可穩(wěn)定在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)發(fā)揮功能，具有作用效果更加長(zhǎng)久的優(yōu)勢(shì)。這一方法現(xiàn)被廣泛用于miRNA功能缺失轉(zhuǎn)基因動(dòng)物構(gòu)建等基礎(chǔ)研究領(lǐng)域以及腫瘤靶向治療的探索研究。如將miRNA海綿序列置于果蠅UAS(upstreamactivesequence，UAS)上游激活序列下游，配合帶組織特異性啟動(dòng)子的GAL4基因?qū)崿F(xiàn)了miRNA在果蠅中組織特異性功能缺失，為在果蠅中研究?jī)?nèi)源miRNA的功能提供了有力工具。因此miRNAsponge抑制載體設(shè)計(jì)與構(gòu)建尤為重要。
制備[1]
miRNA sponge抑制載體設(shè)計(jì)與構(gòu)建中，經(jīng)特異地優(yōu)化設(shè)計(jì)，增強(qiáng)吸附能力的同時(shí)增加了更多的結(jié)合位點(diǎn)，這樣提高了成熟miRNA或siRNA抑制能力，消弱細(xì)胞中miRNA或siRNA導(dǎo)致的基因沉默效應(yīng)，從而進(jìn)行miRNA或siRNA功能缺失性研究。miRNAsponge抑制載體設(shè)計(jì)與構(gòu)建舉例如下：一種多靶向miRNA海綿體序列質(zhì)粒載體的構(gòu)建方法，包括：
步驟1.多靶向miRNA海綿慢病毒載體系統(tǒng)的設(shè)計(jì)：根據(jù)miRbase中miR-155和miR-31成熟序列分別設(shè)計(jì)靶向兩miRNA成熟序列且第9-11堿基錯(cuò)配的序列，設(shè)計(jì)一對(duì)含有四個(gè)錯(cuò)配序列、正反向重疊16個(gè)堿基的引物，分別在正、反向引物中引入酶切位點(diǎn)EcoRI和BamHI；
步驟2.構(gòu)建pCDH-CMV-EGFP-puro質(zhì)粒；
步驟3.使用步驟1中設(shè)計(jì)、合成的引物，將正、反向引物退火及延伸，將延伸出的DNA片段酶切后連接進(jìn)pCDH-CMV-EGFP-puro質(zhì)粒，酶切、測(cè)序驗(yàn)證質(zhì)粒，獲得分別包含miRNA海綿序列的pCDH-EGFP-4xmi155sp-puro質(zhì)粒及pCDH-EGFP-4xmi31sp-puro質(zhì)粒；
步驟4.通過已有的pCDH-EGFP-4xmi155sp-puro質(zhì)粒獲得pCDH-EGFP-8xmi155sp-puro質(zhì)粒；通過已有的pCDH-EGFP-4xmi31sp-puro質(zhì)粒獲得pCDH-EGFP-8xmi31sp-puro質(zhì)粒；
步驟5.構(gòu)建靶向miR-155和miR-31的pCDH-EGFP-8xmi155&31sp-puro海綿慢病毒載體：
1)將所述步驟4獲得的pCDH-EGFP-8xmi155sp-puro質(zhì)粒和pCDH-EGFP-8xmi31sp-puro質(zhì)粒分別雙酶切；
a)為獲得插入片段8xmi155sp或8xmi31sp，SalI-HF及BclI雙酶切pCDH-EGFP-8xmi155sp-puro質(zhì)?；騪CDH-EGFP-8xmi31sp-puro質(zhì)粒；
b)為獲得載體，SalI-HF及BamHI-HF雙酶切pCDH-EGFP-8xmi31sp-puro質(zhì)?；騪CDH-EGFP-8xmi155sp-puro質(zhì)粒；得到開環(huán)的pCDH-EGFP-8xmi31sp-puro質(zhì)?；蜷_環(huán)的pCDH-EGFP-8xmi155sp-puro質(zhì)粒；
2)將插入片段8xmi155sp與開環(huán)的pCDH-EGFP-8xmi31sp-puro質(zhì)粒連接；或者將插入片段8xmi31sp與開環(huán)的pCDH-EGFP-8xmi155sp-puro質(zhì)粒連接重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，單克隆篩選并酶切驗(yàn)證pCDH-EGFP-8xmi155&31sp-puro質(zhì)粒正確性，獲得包含miRNA海綿序列的pCDH-EGFP-8xmi155&31sp-puro質(zhì)粒。
主要參考資料
[1] CN201810755754.6一種多靶向miRNA海綿體序列質(zhì)粒載體及其構(gòu)建方法、引物組合物審中-實(shí)質(zhì)審查