背景^[1-3]

肥大細(xì)胞染色液(甲苯胺藍(lán)法)是一種用于細(xì)胞染色的試劑，可以用于顯示組織中的肥大細(xì)胞。

甲苯胺藍(lán)是常用的人工合成染料的一種屬于醌亞胺染料類，是堿性染料，甲苯胺藍(lán)中的陽離子有染色作用，組織細(xì)胞的酸性物質(zhì)與其中的陽離子相結(jié)合而被染色，可染細(xì)胞核使之呈藍(lán)色；肥大細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)含有肝素和組織胺等異色性物質(zhì)遇到甲苯胺藍(lán)可呈異染性紫紅色，可用于尖銳濕疣的初篩及肥大細(xì)胞的檢測。不推薦用于軟骨、胃粘膜等難染組織的染色。

肥大細(xì)胞染色

肥大細(xì)胞染色液(甲苯胺藍(lán)法)對肥大細(xì)胞的染色操作步驟:

（1）組織脫蠟至水。

（2）蒸餾水浸洗2-3次。

（3）甲苯胺藍(lán)染液染20-30min。

（4）稍水洗，洗去多余染色液。

（5）95%酒精分色，在鏡下控制分色效果。

（6）用100%酒精脫水。

（7）二甲苯透明，中性樹膠封片。

肥大細(xì)胞染色結(jié)果：肥大細(xì)胞顆粒呈紅紫色，胞核呈藍(lán)色。

肥大細(xì)胞染色液(甲苯胺藍(lán)法)對細(xì)胞涂片的染色操作步驟：

（1）細(xì)胞涂片后，立即放入95%的乙醇中固定，取出放在紙巾上。

（2）滴加1～2滴稀釋后的甲苯胺藍(lán)染色液進(jìn)行滴染，加蓋玻片讓染料滲透到細(xì)胞中。

（3）后將玻片豎起，稍加壓力，使多余染料被紙巾吸去。

（4）無需干燥，直接鏡檢。

細(xì)胞涂片染色結(jié)果：細(xì)胞核、淋巴細(xì)胞呈深藍(lán)色；核仁呈紫紅色；紅細(xì)胞呈橘紅；細(xì)胞質(zhì)、單核細(xì)胞呈淡藍(lán)色。

肥大細(xì)胞染色液(甲苯胺藍(lán)法)在原位雜交中染色操作步驟：

（1）用蒸餾水或去離子水稀釋到相應(yīng)的濃度，憑經(jīng)驗一般稀釋比例大于1:10。

（2）玻片在稀釋好的染色液中短暫浸泡。

（3）在蒸餾水或去離子水浸泡數(shù)次。

（4）按需求進(jìn)行壓片固定。

肥大細(xì)胞染色液(甲苯胺藍(lán)法)在神經(jīng)元細(xì)胞的染色操作步驟：

（1）將載有細(xì)胞的玻片取出放入4％多聚甲醛中固定1h左右；

（2）到時間后取出用PBS沖洗1～2次即可；

（3）然后加入提前預(yù)熱的1％甲苯胺藍(lán)溶液，在50度左右的氣浴或水浴中染色20～30min；

（4）用梯度酒精已次脫水，分別為75％、90％、100％，也可自定梯度；

（5）在鏡下控制分色效果，這一步不太好掌握；

神經(jīng)元細(xì)胞染色結(jié)果：可見尼氏小體深藍(lán)色顆粒，細(xì)胞核呈淡藍(lán)色，背景基本無色。

應(yīng)用^[4-5]

肥大細(xì)胞染色液(甲苯胺藍(lán)法)可以用于大鼠脊髓Fos免疫陽性神經(jīng)元和外周肥大細(xì)胞參與炎性痛覺過敏

部分弗氏佐劑致炎大鼠脊髓背角神經(jīng)元Fos蛋白的表達(dá)目的探討完全弗氏佐劑(CFA)所致炎性痛大鼠Fos蛋白在脊髓背角痛覺傳導(dǎo)通路中的表達(dá)及意義。

方法1)16只SD大鼠隨機均分為NS和CFA兩組(n=8),于大鼠右后肢踝關(guān)節(jié)外側(cè)皮下分別注射0.9%生理鹽水(NS)或完全弗氏佐劑(CFA)50μl,在注射NS或CFA前和注射后1h、4h、12h、1d、3d、7d、14d共8個時刻點用熱敏測痛法測定大鼠熱縮足反射潛伏期TWL。

2)48只大鼠隨機平分為NS和CFA兩組后(n=24),分別注射NS或CFA(劑量和注射部位同前),以免疫組化法檢測脊髓背角神經(jīng)元上述8個時刻點Fos蛋白的表達(dá)。

結(jié)果1)NS組大鼠右足注射NS前后TWL變化不明顯(p>0.05);大鼠注射CFA數(shù)小時后右足即產(chǎn)生顯著的紅腫等炎癥表現(xiàn),在4h、12h、1d、3d和7d等5個觀察時點,CFA組TWL與NS組相比出現(xiàn)明顯降低(p<0.01),12h時為最低點(p<0.01),持續(xù)3d后逐漸恢復(fù)(p<0.01),14d時基本恢復(fù)至基礎(chǔ)水平(p>0.05)。

2)NS組脊髓背角Fos免疫陽性神經(jīng)元(Fos-LIN)基本不表達(dá)或散在出現(xiàn),與基礎(chǔ)值相比無明顯差異(p>0.05);CFA組中Fos-LIN 1h時最先出現(xiàn)在大鼠右側(cè)脊髓背角I-II層(與NS組比較,p<0.01),4h時V-VI層的Fos-LIN數(shù)目逐漸增多(與NS組比較,p<0.01),12h時為脊髓全層Fos-LIN最多出現(xiàn)的時間點,14d時,背角I、II、V、VI層基本未見Fos陽性染色神經(jīng)元(與NS組比較,p>0.05),同組右側(cè)脊髓III、IV、VII、X層Fos-LIN在1h-14d均比較少見。

結(jié)論50μl CFA能誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生為期2周的炎性痛覺過敏。炎癥期間脊髓背角神經(jīng)元Fos蛋白持續(xù)表達(dá),且其表達(dá)與外周痛覺信號的傳導(dǎo)和中樞的調(diào)控有關(guān)。第二部分炎性痛大鼠模型中外周肥大細(xì)胞的表達(dá)和作用

研究完全弗氏佐劑(CFA)所致炎性痛大鼠模型中炎癥局部肥大細(xì)胞(MCs)的表達(dá),探討肥大細(xì)胞在炎性痛中的可能作用機制。

方法SD大鼠54只,隨機均分為兩組(n=27),于右后肢踝關(guān)節(jié)外側(cè)皮下分別注射生理鹽水(NS)或0.1%CFA 50μl。取大鼠注射藥物局部皮膚和皮下組織用肥大細(xì)胞染色液(甲苯胺藍(lán)法)染色MCs,并觀察注射CFA前(T0)和注射后1h、4h、12h、1d、3d、7d、9d、14d共9個時刻點MCs的數(shù)目和形態(tài)學(xué)變化。

結(jié)果1)NS組大鼠右足在1h-14d期間MCs總數(shù)和脫顆粒數(shù)目無顯著差異(p>0.05),高倍光鏡下紫紅色肥大細(xì)胞形狀規(guī)則,少見脫顆粒細(xì)胞;2)與NS組相比,CFA組大鼠MCs總數(shù)在1h時明顯上升(p<0.01),在7d時最多,14d時仍明顯高于NS組同時刻點(p<0.01);脫顆粒MCs數(shù)在1h時明顯增多(p<0.01),12h時達(dá)到高峰,1d后漸降,14d時基本正常(p>0.05),鏡下見MCs胞體增大、胞膜破裂、胞漿淡染,細(xì)胞多呈不規(guī)則狀,周圍多見紫紅色顆粒。結(jié)論肥大細(xì)胞通過聚集和脫顆粒啟動并參與炎性痛的發(fā)生和維持。

參考文獻(xiàn)

[1]Anti-IgE as a mast cell–stabilizing therapeutic agent.Tse Wen Chang;;Yu-Yu Shiung.The Journal of Allergy and Clinical Immunology,2006

[2]Involvement of protein kinase C in 5-HT-evoked thermal hyperalgesia and spinal fos protein expression in the rat.Xuejiao Chen;;Feihong Bing;;Peifang Dai;;Yanguo Hong.Pharmacology,Biochemistry and Behavior,2006

[3]TGFβ1 induces mast cell apoptosis.Farnaz Norozian;;Mohit Kashyap;;Carlos D.Ramirez;;Neha Patel;;Christopher L.Kepley;;Brian O.Barnstein;;John J.Ryan.Experimental Hematology,2006

[4]TGF-β1 inhibits late-stage mast cell maturation.Mohit Kashyap;;Daniel P.Bailey;;Gregorio Gomez;;Juan Rivera;;Thomas F.Huff;;John J.Ryan.Experimental Hematology,2005

[5]余健.大鼠脊髓Fos免疫陽性神經(jīng)元和外周肥大細(xì)胞參與炎性痛覺過敏[D].蘇州大學(xué),2008.