背景^[1-3]

小鼠淋巴管內(nèi)皮細胞是研究淋巴系統(tǒng)和淋巴管內(nèi)皮細胞功能的重要工具之一。這些細胞可以在體外進行培養(yǎng)，并且有一些特定的特征和生長條件。

小鼠淋巴管內(nèi)皮細胞的細胞形態(tài)可能包括鋪路石狀細胞和不規(guī)則細胞。這些細胞在生長過程中會貼壁生長，并需要特定的培養(yǎng)條件，例如氣相和溫度等。一般來說，這些細胞會在37℃下進行培養(yǎng)，并且需要定期進行傳代和凍存。

在進行小鼠淋巴管內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)時，需要注意一些細節(jié)。例如，這些細胞需要使用完全培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，并且需要添加一定濃度的DMSO進行凍存。此外，這些細胞需要進行QC檢測，以確保其純度和安全性。一般來說，這些細胞的QC檢測項目包括鑒定vEGFR-3熒光染色和支原體、細菌、酵母和真菌等微生物的檢測。

小鼠淋巴管內(nèi)皮細胞

小鼠淋巴管內(nèi)皮細胞復(fù)蘇操作：

1）將培養(yǎng)基在37℃水浴鍋預(yù)熱；準備一個15mL無菌的離心管，加入8mL預(yù)熱培養(yǎng)基。

2）將凍存小鼠淋巴管內(nèi)皮細胞從液氮罐中取出，快速放入37℃水浴鍋中復(fù)溫（可準備一潔凈的燒杯，裝滿37℃的水，細胞凍存管取出后迅速放入燒杯內(nèi)，再逐步轉(zhuǎn)移到水浴鍋中）。輕輕晃動凍存管，使細胞能在1~2min內(nèi)完全解凍，使細胞能盡快通過最易受損的溫度段（-5~0℃）。注意凍存管管口不能沒入水中，BIU-87(人膀胱癌細胞)避免引起污染。

3）用75%酒精擦拭凍存管后再置于超凈臺內(nèi)，將管內(nèi)細胞轉(zhuǎn)移至準備好的離心管內(nèi)，輕輕吹打液體，使細胞均勻分散，降低DMSO濃度，吹打時避免產(chǎn)生氣泡。用新鮮培養(yǎng)基洗管壁2次，均轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)。

4）800rpm離心5min，棄上清，加入新鮮的培養(yǎng)基，吹打制成細胞懸液。

5）將小鼠淋巴管內(nèi)皮細胞懸液轉(zhuǎn)移至T25細胞瓶內(nèi)，補加適量的培養(yǎng)基，輕輕晃動細胞瓶使細胞分布均勻，放入溫箱內(nèi)培養(yǎng)。

6）第二天觀察細胞貼壁生長情況，換新鮮培養(yǎng)基以去除死細胞。繼續(xù)培養(yǎng)，待細胞長至80~90%匯合時正常傳代。一般剛復(fù)蘇的細胞需經(jīng)過2~3次傳代，細胞活力恢復(fù)后才能進行后續(xù)的實驗。

應(yīng)用^[4-5]

小鼠淋巴管內(nèi)皮細胞可以用于淋巴管內(nèi)皮細胞通過NIK調(diào)節(jié)B細胞淋巴結(jié)歸巢及SAPHO綜合征外周血γδT細胞相關(guān)研究

淋巴細胞歸巢過程的分子基礎(chǔ)是淋巴細胞與各組織、器官血管內(nèi)皮細胞粘附分子的相互作用。其中,B細胞歸巢到淋巴結(jié)的過程需要通過高內(nèi)皮小靜脈在趨化因子(尤其是CXCL13)的指導(dǎo)下完成。然而,CXCL13并不是由高內(nèi)皮小靜脈直接產(chǎn)生,其如何介導(dǎo)B細胞歸巢到淋巴結(jié)的分子機制目前還未闡明。NF-κB信號通路參與免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、細胞凋亡、腫瘤發(fā)生等多種生物進程。NIK作為非經(jīng)典NF-κB途徑的關(guān)鍵分子也在維持完整的淋巴系統(tǒng)功能,特別是在維持完整的淋巴結(jié)和B細胞群,發(fā)揮重要作用。但對于其在淋巴管內(nèi)皮細胞中的作用仍不甚明了,本研究旨在探索淋巴管內(nèi)皮細胞中的NIK分子對于淋巴管功能的影響及其分子機制。

方法:本研究將NIK-flox小鼠與Lyvel EGFP-hCre小鼠交配繁育出淋巴管內(nèi)皮細胞條件性敲除NIK的小鼠(NIKLEC-KO,NIKfl/flLyvel+/Cre)及同窩對照的野生型(NIK+/+Lyvel+/Cre)小鼠。

首先通過流式細胞術(shù)對小鼠的免疫器官進行表型分析,并通過耳部淋巴回流功能檢測和異硫氰酸熒光素著色實驗,評價NIKLEC-KO小鼠淋巴管引流液體和運輸樹突狀細胞的功能。然后利用體內(nèi)歸巢實驗檢測主要細胞亞群的歸巢情況。

通過RT-qPCR分析相關(guān)趨化因子的表達,最后免疫小鼠通過酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測小鼠的抗體分泌能力以評價其體液免疫功能。

結(jié)果:在本研究中,發(fā)現(xiàn)介導(dǎo)非經(jīng)典NF-κB途徑活化的激酶NIK對淋巴管內(nèi)皮細胞介導(dǎo)的B細胞歸巢到淋巴結(jié)發(fā)揮了重要作用。淋巴管內(nèi)皮細胞條件性敲除NIK的小鼠并未表現(xiàn)出淋巴管的完整性破壞或整體功能的異常,但卻表現(xiàn)出淋巴結(jié)中的B細胞比例顯著降低。而在該小鼠脾臟中并未出現(xiàn)B細胞比例及生存狀態(tài)的異常。B細胞的過繼轉(zhuǎn)移實驗發(fā)現(xiàn)淋巴管內(nèi)皮細胞特異性敲除NIK使淋巴結(jié)招募B細胞的功能發(fā)生障礙。此外,本研究進一步發(fā)現(xiàn)NIK介導(dǎo)淋巴管內(nèi)皮細胞CXCL13和CCL19的表達。

結(jié)論:NIK是通過調(diào)節(jié)淋巴管內(nèi)皮細胞產(chǎn)生B細胞歸巢趨化因子CXCL13進而使初始B細胞歸巢到淋巴結(jié)。

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