背景^[1-3]

小鼠角膜上皮細胞采用酶解法制備而來，CK-18、CK-19免疫熒光鑒定呈陽性，細胞純度可達90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、細菌、酵母和真菌等。

小鼠角膜上皮細胞是一種常用的細胞模型，在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究中具有廣泛的應(yīng)用。這些細胞可以用于研究角膜疾病的發(fā)病機制、藥物篩選和細胞替代治療等。

在體外培養(yǎng)小鼠角膜上皮細胞時，需要提供適宜的培養(yǎng)環(huán)境，包括特定的培養(yǎng)基、血清、生長因子等。這些細胞通常會在傳代后逐漸失去原有的細胞形態(tài)和功能，因此需要進行及時更換。

為了保證細胞的純度和質(zhì)量，需要進行細胞類型特異性標(biāo)記物檢測和微生物檢測等質(zhì)量控制措施。在實驗室培養(yǎng)小鼠角膜上皮細胞時，也需要對細胞進行嚴(yán)格的操作和管理，以避免交叉感染和保證細胞的可靠性。

小鼠角膜上皮細胞

小鼠角膜上皮細胞復(fù)蘇操作：

1）將培養(yǎng)基在37℃水浴鍋預(yù)熱；準(zhǔn)備一個15mL無菌的離心管，加入8mL預(yù)熱培養(yǎng)基。

2）將凍存小鼠角膜上皮細胞從液氮罐中取出，快速放入37℃水浴鍋中復(fù)溫（可準(zhǔn)備一潔凈的燒杯，裝滿37℃的水，細胞凍存管取出后迅速放入燒杯內(nèi)，再逐步轉(zhuǎn)移到水浴鍋中）。輕輕晃動凍存管，使細胞能在1~2min內(nèi)完全解凍，使細胞能盡快通過最易受損的溫度段（-5~0℃）。注意凍存管管口不能沒入水中，BIU-87(人膀胱癌細胞)避免引起污染。

3）用75%酒精擦拭凍存管后再置于超凈臺內(nèi)，將管內(nèi)細胞轉(zhuǎn)移至準(zhǔn)備好的離心管內(nèi)，輕輕吹打液體，使細胞均勻分散，降低DMSO濃度，吹打時避免產(chǎn)生氣泡。用新鮮培養(yǎng)基洗管壁2次，均轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)。

4）800rpm離心5min，棄上清，加入新鮮的培養(yǎng)基，吹打制成細胞懸液。

5）將小鼠角膜上皮細胞懸液轉(zhuǎn)移至T25細胞瓶內(nèi)，補加適量的培養(yǎng)基，輕輕晃動細胞瓶使細胞分布均勻，放入溫箱內(nèi)培養(yǎng)。

6）第二天觀察細胞貼壁生長情況，換新鮮培養(yǎng)基以去除死細胞。繼續(xù)培養(yǎng)，待細胞長至80~90%匯合時正常傳代。一般剛復(fù)蘇的細胞需經(jīng)過2~3次傳代，細胞活力恢復(fù)后才能進行后續(xù)的實驗。

應(yīng)用^[4-5]

小鼠角膜上皮細胞可以用于新型小分子復(fù)合物對小鼠角膜上皮細胞體外擴增的作用

探究六種小分子化合物(six chemicals,6C)在無血清無滋養(yǎng)層條件下,對原代小鼠角膜上皮細胞增殖能力和細胞分化表型的影響,并以此開發(fā)構(gòu)建組織工程小鼠角膜上皮植片。

方法:原代小鼠角膜上皮細胞的培養(yǎng)基中添加不同的化合物組合,在經(jīng)過傳代/連續(xù)培養(yǎng)后,通過結(jié)晶紫染色、生長曲線和克隆形成效率評估原代小鼠角膜上皮細胞的增殖活性;通過免疫熒光染色和實時熒光定量PCR分析原代小鼠角膜上皮細胞和上皮-間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)相關(guān)基因的表達;在小鼠角膜上皮損傷愈合模型中,以6C組分溶液進行點眼處理,通過熒光素鈉染色評估角膜上皮愈合速度;在空氣暴露培養(yǎng)體系中添加不同小分子組分,通過對培養(yǎng)形成的角膜上皮植片進行免疫染色,評估植片中上皮細胞的生長和表型分化。

結(jié)果:在長期培養(yǎng)以及傳代培養(yǎng)中,6C復(fù)合物增加了原代小鼠角膜上皮細胞的增殖活性。在體實驗顯示6C能夠加速小鼠角膜上皮傷口的愈合。

同時,這種復(fù)合物抑制了EMT相關(guān)標(biāo)記物ZEB1/2、Snail、β-catenin和α-SMA等表達水平的增加,而與此同時,維持了原代小鼠角膜上皮細胞功能相關(guān)標(biāo)記物p63、K14、Pax6和K12等的表達。6C復(fù)合物的這種保護作用表明,它可以通過延長功能性干/祖細胞活性的壽命來減少其向間充質(zhì)細胞的轉(zhuǎn)分化。

此外,在空氣暴露培養(yǎng)體系中添加6C復(fù)合物,可形成可用于移植手術(shù)的組織工程小鼠角膜上皮片。

結(jié)論:6C復(fù)合物既抑制了原代小鼠角膜上皮細胞增殖活性的傳代依賴性下降,又抑制了EMT的增加。這些影響表明,這種新型6C復(fù)合物可能有助于改善角膜緣干細胞缺乏癥的治療。

參考文獻

[1]Flow micropillar array electroporation to enhance size specific transfection to a large population of cells.Yingbo Zu;;Xuan Liu;;An-Yi Chang;;Shengnian Wang.Bioelectrochemistry,2020

[2]Highly uniform in-situ cell electrotransfection of adherent cultures using grouped interdigitated electrodes.Yicen Zhou;;Ying Lu;;Jing Cheng;;Youchun Xu.Bioelectrochemistry,2020

[3]Transcription Factor 4 Regulates the Regeneration of Corneal Endothelial Cells..Hwang Jin Sun;;Yoon Chang Ki;;Hyon Joon Young;;Chung Tae-Young;;Shin Young Joo.Investigative ophthalmology&visual science,2020

[4]HCE-T cell line lacks cornea-specific differentiation markers compared to primary limbal epithelial cells and differentiated corneal epithelium..Rubelowski Anna-Klara;;Latta Lorenz;;Katiyar Priya;;Stachon Tanja;;K?smann-Kellner Barbara;;Seitz Berthold;;Szentmáry Nóra.Graefe's archive for clinical and experimental ophthalmology=Albrecht von Graefes Archiv fur klinische und experimentelle Ophthalmologie,2020

[5]安小婭.新型小分子復(fù)合物對小鼠角膜上皮細胞體外擴增的作用[D].廈門大學(xué),2021.