研究背景：

L-酪氨酸在醫(yī)藥和化學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。L-酪氨酸是許多重要次級代謝產(chǎn)物的前體，也是帕金森氏病藥物3,4-二羥基-L-苯丙氨酸（L-DOPA）的重要前體。由于其生物合成途徑長，調(diào)控復(fù)雜，利用微生物生產(chǎn)L-酪氨酸仍面臨諸多挑戰(zhàn)。

摘要：

之前關(guān)于L-酪氨酸過量合成的研究報(bào)道，最多見失活其轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子（由tyrR編碼），及解除兩個(gè)關(guān)鍵基因（aroG、tyrA）的反饋抑制。本研究通過實(shí)驗(yàn)提出了新的觀點(diǎn)，tyrR基因的失活對L-酪氨酸的過量合成并不是必須的，而合適的補(bǔ)料策略，及內(nèi)運(yùn)蛋白（由tyrP編碼）的失活，對過量合成L-酪氨酸則更為有效。

圖1：大腸桿菌中L-酪氨酸生物合成途徑

文章脈絡(luò)：

（1）aroGfbr和tyrAfbr單基因過表達(dá)對酪氨酸產(chǎn)量的影響

分別以大腸桿菌BL21(DE3)和tyrR敲除菌株為出發(fā)菌，利用兩種不同表達(dá)水平質(zhì)粒單獨(dú)過表達(dá)aroGfbr和tyrAfbr。搖瓶測定發(fā)現(xiàn)，在L-酪氨酸生產(chǎn)中aroGfbr過表達(dá)較tyrAfbr更有效。但菌株BTY1.1的代謝通量分布不理想，產(chǎn)生了大量的副產(chǎn)物L(fēng)-苯丙氨酸。

（2）aroGfbr與tyrAfbr，aroL或aroK兩基因過表達(dá)對酪氨酸產(chǎn)量影響

在野生型與tyrR敲除菌株中，aroGfbr分別與tyrAfbr，aroL，aroK，aroBopt或aroE過表達(dá)。發(fā)現(xiàn)在本研究表達(dá)系統(tǒng)，aroGfbr與aroL組合，推測aroL編碼酶催化的莽草酸轉(zhuǎn)化為莽草酸磷酸酯，是本表達(dá)系統(tǒng)的限速步驟。但過表達(dá)組合均未達(dá)到單獨(dú)過表達(dá)aroGfbr的L-酪氨酸產(chǎn)量。

（3）aroGfbr、aroL與tyrAfbr或tyrC三基因過表達(dá)對酪氨酸產(chǎn)量的影響

在野生型與tyrR敲除菌株中，分別利用雙載體系統(tǒng)與單載體系統(tǒng)檢測aroGfbr，aroL和tyrAfbr或tyrC過表達(dá)效果。發(fā)現(xiàn)單載體表達(dá)系統(tǒng)效果較好，tyrC無論在何種表達(dá)體統(tǒng)，對于L-酪氨酸的產(chǎn)生都比tyrAfbr更有效。（注：tyrC為運(yùn)動(dòng)假單胞菌來源，具有與tyrA相似的功能，但tyrC對L-酪氨酸不敏感。）

（4）刪除酪氨酸特異性和芳香族氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對酪氨酸產(chǎn)量的影響

在野生型與tyrR敲除菌株中，依次進(jìn)行tyrP（L-酪氨酸特異性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白）敲除、aroP（芳香族氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白）、tyrP和aroP雙敲除，并導(dǎo)入單載體三基因表達(dá)系統(tǒng)。發(fā)現(xiàn)高產(chǎn)L-酪氨酸的三種菌株（BTY5.13，BTY2.13和BTY7.13）均失活了tyrP，表明失活tyrP有助于改善L-酪氨酸生產(chǎn)。

（5）補(bǔ)料分批發(fā)酵

在5L生物反應(yīng)器中分別采用Exponential-to-DO-stat和DO-stat補(bǔ)料策略測定四種改造菌。菌株BTY2.13，其采用Exponential-to-DO-stat補(bǔ)料策略發(fā)酵，L-酪氨酸產(chǎn)量可達(dá)43.14g/ L，轉(zhuǎn)化率達(dá)0.107g /g。

 表1：不同補(bǔ)料策略下改造菌的生長及產(chǎn)物合成情況

結(jié)論：

tyrR基因失活對于L-酪氨酸生產(chǎn)不是必需性的，而較優(yōu)的載體系統(tǒng)和補(bǔ)料策略，以及內(nèi)運(yùn)蛋白tyrP的失活，對L-酪氨酸過量合成更為有效。

DO-stat補(bǔ)料模式下，tyrR未失活菌的乙酸較多，說明其代謝發(fā)生溢流，其機(jī)理仍需進(jìn)一步研究和探索。