背景及概述^[1]

寡核苷酸藥物 (oligonucleotides, ONs) 是由人工化學(xué)合成的 12～30 個(gè)核糖寡核苷酸單鏈或雙鏈組成的一類藥物, 通過(guò) Watson-Crick 堿基配對(duì)原則作用于目標(biāo)信使 RNA (mRNA) 主要分為反義寡核苷酸藥物 (antisense oligonucleotides, ASOs) 和小干擾RNA藥物 (small interference RNA, siRNA) 兩大類。

雖然人工合成寡核苷酸調(diào)節(jié)靶向基因表達(dá)的概念在 40 年前就被提出, 但是因?yàn)楹怂岬乃巹?dòng)學(xué)成藥性差、脫靶毒性、遞藥系統(tǒng)等技術(shù)瓶頸沒(méi)有解決, 主要用于細(xì)胞或動(dòng)物科研實(shí)驗(yàn)中的基因敲除。隨著過(guò)去20年化學(xué)和生物技術(shù)的發(fā)展, 一些關(guān)鍵技術(shù)難題被攻克,全球迎來(lái)核酸類藥物研發(fā)熱潮。2016至 2019短短 3年間, 美國(guó) FDA 就批準(zhǔn)了 4個(gè)反義寡核苷酸類藥物 (Defibrotide、Eteplirsen、Nusinersenand和 Inotersen) 和 2個(gè) siRNA 藥物 (Patisiran、Gi‐vosiran), 其調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄翻譯的機(jī)制引起制藥行業(yè)關(guān)注。一些罕見、疑難疾病, 如遺傳性轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白淀粉樣變性、杜氏肌萎縮癥、乙型肝炎等仍然不能得到有效治愈, 核酸類藥物通過(guò)基因敲除或者剪接調(diào)控機(jī)制有望填補(bǔ)小分子藥物和單克隆抗體藥物的空白治療領(lǐng)域。目前全球有50多個(gè)寡核苷酸藥物處于不同的臨床研究階段, 覆蓋罕見病、難治愈疾病多個(gè)治療領(lǐng)域。中國(guó)寡核苷酸藥物的研發(fā)公司多處于起步階段,主要集中在昆山小核酸產(chǎn)業(yè)基地。

成藥性改造面臨的挑戰(zhàn)^[1]

1 化學(xué)修飾

未經(jīng)化學(xué)修飾的寡核苷酸藥物成藥性通常不理想。它們具有較差的 PK 特性, 比如穩(wěn)定性差, 易被核酸酶降解; 極性大, 很難進(jìn)入細(xì)胞, 分布特性差; 對(duì)目標(biāo) mRNA的結(jié)合親和力不佳。為了達(dá)到臨床效用, 寡核苷酸必須經(jīng)過(guò)化學(xué)改造 (圖 1)。

目前廣為使用的結(jié)構(gòu)改造的基礎(chǔ)骨架是磷硫 (PS) 修飾, 即將非橋接的磷酸二酯氧替換成硫原子。PS 骨架的修飾減少了寡核苷酸的親水性、增加了對(duì)核酸酶降解的抵抗力以及增加了其與血漿蛋白結(jié)合 進(jìn)而使得寡核酸穩(wěn)定性增加, 減少腎小球?yàn)V過(guò)到尿液中排泄。PS骨架的改造雖然改善了部分PK特性, 使其系統(tǒng)暴露增加進(jìn)而增加細(xì)胞攝取和轉(zhuǎn)運(yùn), 但是單一的PS骨架修飾不能保障寡核苷酸不被酶降解, 并且在高濃度時(shí)這種修飾降低了寡核苷酸和靶標(biāo)的親和力, 使機(jī)體產(chǎn)生炎癥反應(yīng)。為了進(jìn)一步增加靶標(biāo)結(jié)合親和力、抵抗核酸酶降解、減少促炎癥反應(yīng), 在20世紀(jì)90年代出現(xiàn)了具有糖基修飾的二代寡核苷酸藥物二代寡核苷酸是在 PS 骨架修飾的基礎(chǔ)上將2′-羥基 (2′-hydroxyl, 2′-OH) 替換成2′-甲氧基 (2′-O-methyl, 2′-O-Me)、2′-甲氧乙氧基 (2′-Omethoxyethyl, 2′-MOE)、2′-氟 (2′-fluoro, 2′-F) 或者引入構(gòu)象約束結(jié)構(gòu), 比如鎖核酸 (locked nucleic acid, LNA)以及它的甲基化衍生物即約束乙基 (constrained ethyl,cEt)。2′-F或者2′-O-Me 20世紀(jì)60年代就合成了, 但是30年后才應(yīng)用到臨床治療中。2′-O-Me的修飾提高了靶標(biāo)親和力、核酸酶降解的抵抗力以及減弱 PS 骨架引起的免疫刺激性，在 2′-O-Me 基礎(chǔ)上, 2′-MOE可以進(jìn)一步增加靶標(biāo)結(jié)合親和力和抵抗核酸酶降解。而相對(duì)于 2′-MOE, LNA、cEt 結(jié)構(gòu)降低了構(gòu)象靈活性,與靶標(biāo)親和性增加了5～10倍然而LNA和cEt報(bào)道和肝毒性有關(guān), 這種肝毒性可能由脫靶降解不匹配的RNA造成。目前仍在探索其他的結(jié)構(gòu)化學(xué)改造方式, 2′-MOE在反義寡核苷酸藥物中應(yīng)用最多。上市的Mipomersen、Nusinersen 和 Inotersen 均是這種化學(xué)修飾, 同時(shí)還有 20 多個(gè)同類藥處于臨床不同研究階段。但是對(duì)于 siRNA 而言, 2′-MOE 改造應(yīng)用有限, siRNA廣泛應(yīng)用 2′-F 或者 2′-O-Me, 如上市的 Patisiran, 同時(shí)應(yīng)用了2′-F和2′-O-Me修飾。

2 細(xì)胞內(nèi)遞送

單克隆抗體藥物通常和細(xì)胞外的可溶性靶標(biāo)或者細(xì)胞表面的靶標(biāo)結(jié)合發(fā)揮治療作用, 而寡核苷酸藥物必須進(jìn)入細(xì)胞才能產(chǎn)生藥理活性。和小分子相比, 寡核苷酸藥物的分子質(zhì)量較大 (6～14 kDa), 高度帶負(fù)電,親水性高, 不易透過(guò)脂質(zhì)雙分子層和血腦屏障。沒(méi)有遞送系統(tǒng)的ASOs (～7 kDa), 大多數(shù)通過(guò)網(wǎng)格蛋白或者小窩蛋白介導(dǎo)的胞飲作用攝取進(jìn)細(xì)胞。寡核苷酸的細(xì)胞內(nèi)化分為“有效途徑”和“無(wú)效途徑”“有效途徑”有依賴于非巨胞飲作用和內(nèi)含體的細(xì)胞內(nèi)分布, 寡核苷酸從內(nèi)含體逃逸出來(lái), 進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核內(nèi)發(fā)揮藥理作用, 而“無(wú)效途徑”也就是巨胞飲途徑, 導(dǎo)致寡核苷酸聚集在溶酶體中被降解或清除出細(xì)胞。在內(nèi)含體中有很多和先天免疫相關(guān)的Toll樣受體 (Toll like receptors, TLRs), 當(dāng)TLRs識(shí)別進(jìn)入內(nèi)含體的 ONs可能會(huì)引起干擾素和其他細(xì)胞因子的激活。這個(gè)問(wèn)題在代核酸類藥物中比較常見, 第二代核酸經(jīng)過(guò)核糖骨架的 2′-O-甲基等修飾很大程度上解決了這個(gè)問(wèn)題。

和分子質(zhì)量～7kDa的ASOs相比, 分子質(zhì)量～14 kDa的雙鏈siRNA因?yàn)檩^大分子體積和親水性, 經(jīng)細(xì)胞攝取有限。為了增加細(xì)胞攝取, siRNA通常連接靶向配體, 比如N-乙酰半乳糖胺 (N-acetylgalactosamine, GalNAc)包裹在脂質(zhì)納米粒中。

參考文獻(xiàn)

[1]湯仙閣,關(guān)曉多,陳銳,胡蓓.寡核苷酸藥物的臨床藥理學(xué)研究進(jìn)展[J].藥學(xué)學(xué)報(bào),2020,55(02):218-225.