背景^[1-3]

蝙蝠肺細胞分離自蝙蝠肺組織形態(tài)為貼壁生長。肺是機體的呼吸器官，位于胸腔，左右各一，覆蓋于心之上。肺有分葉，左二右三，共五葉。肺經(jīng)肺系（指氣管、支氣管等）與喉、鼻相連，故稱喉為肺之門戶，鼻為肺之外竅。肺泡由單層上皮細胞構(gòu)成的半球狀囊泡。肺中的支氣管經(jīng)多次反復分枝成無數(shù)細支氣管，它們的末端膨大成囊，囊的四周有很多突出的小囊泡，即為肺泡。

蝙蝠肺細胞

細胞復蘇操作步驟：

1．將冷凍管迅速由液氮轉(zhuǎn)入到37℃水浴中，冷凍管的頂部保持在水面以上以避免任何污染，不定時攪拌加速解凍；

2．當細胞完全解凍后，用含70%乙醇的紗布擦拭冷凍管消毒；

3．將解凍后細胞轉(zhuǎn)移到含4℃預平衡培養(yǎng)液的試管中；

4．細胞懸液在4℃下200磄離心10分鐘；

5．棄上清，將細胞重新懸浮在新鮮培養(yǎng)液中；

6．將細胞轉(zhuǎn)移到細胞培養(yǎng)瓶，CO2孵箱中培養(yǎng)；

7．是用倒置顯微鏡檢查細胞存活率以及細胞密度，如果細胞密度過高，用培養(yǎng)液稀釋至適宜濃度。

收到細胞后，取出培養(yǎng)瓶在倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況。

（一）如果細胞未長滿，用75%酒精噴灑整個瓶消毒后放到超菌臺內(nèi)，嚴格無菌操作，打開細胞培養(yǎng)瓶，吸出培養(yǎng)液，僅留下10ml培養(yǎng)液在瓶內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。

（二）如果細胞已長滿，即可進行傳代培養(yǎng)。具體步驟如下：

1.棄去培養(yǎng)液，用PBS（不含鈣，鎂離子）洗1-2次。

2.加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，倒轉(zhuǎn)放于37度培養(yǎng)箱1-3分鐘預熱，然后又將培養(yǎng)瓶倒轉(zhuǎn)大約30秒后，在倒置顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓分散，輕敲幾下培養(yǎng)培養(yǎng)瓶，細胞隨即脫落下來。

3.加入6-8ml完全培養(yǎng)基，吸出，分到新的培養(yǎng)瓶中。1:3~1:6傳代；2~3天1次。

應用^[4][5]

用于蝙蝠葛蘇林堿增效順鉑肺癌化療的效果及機制研究

研究表明順鉑在治療肺癌過程中會誘導肺癌細胞產(chǎn)生自噬活性,這是產(chǎn)生順鉑耐藥的關(guān)鍵機制之一,因此抑制自噬就成為增效順鉑對肺癌治療效果的有前景的策略之一。

通過體內(nèi)外實驗對中藥小分子蝙蝠葛蘇林堿抑制自噬的效果和機制以及增效順鉑治療肺癌的效果和機制進行深入的探索和研究。

方法:（1）蝙蝠葛蘇林堿對肺癌細胞自噬的影響1、通過免疫熒光染色標記自噬體,檢測蝙蝠葛蘇林堿作用后肺癌細胞中自噬體數(shù)量的變化。

2、通過Western blot實驗檢測蝙蝠葛蘇林堿作用后肺癌細胞中自噬相關(guān)指標p62和LC3蛋白水平的變化。

3、通過mCherry-GFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染實驗檢測蝙蝠葛蘇林堿作用后肺癌細胞中自噬流的變化。

參考文獻

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[5]王坤.蝙蝠葛蘇林堿增效順鉑肺癌化療的效果及機制研究[D].廣州中醫(yī)藥大學,2020.