背景[1-3]
血液DNA提取試劑盒可用于全血樣本的基因組DNA的純化。純化原理是首先利用紅細(xì)胞裂解液先去除血液中的紅細(xì)胞，細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞核釋放基因組DNA，由硅膠膜柱可逆吸附體系內(nèi)的基因組DNA，經(jīng)蛋白酶消化、漂洗液清洗除去蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等雜質(zhì)后，用純化液洗脫獲得基因組DNA。
血液DNA電泳檢測(cè)圖
血液DNA提取試劑盒適用于未凝固全血，以及經(jīng)各種抗凝劑（EDTA、肝素、檸檬酸）處理過(guò)的全血樣本。一次可從0.4 ml全血中提取到3-10μg高純度基因組DNA（OD260/OD280=1.7-1.9），此基因組DNA可直接用于PCR、酶切等后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
操作方法
1取血液樣本，每400μl血液加入到一只1.5ml離心管中。加入2倍體積的紅細(xì)胞裂解液RS。漩渦振蕩或上下來(lái)回顛倒混勻。5,000 rpm離心3min，棄上清，收集白色或淡紅色沉淀。
對(duì)于哺乳動(dòng)物全血，每400μ全血中可提取3-10μg的基因組DNA。如從鳥類、兩棲類或更低級(jí)的動(dòng)物血液中提取基因組DNA，因其血液中紅細(xì)胞有細(xì)胞核，血液用量勿超過(guò)20μl/離心管。每20μl全血中可提取40μg的基因組DNA。
2加入200μl消化緩沖液DS，旋渦振蕩直至完全分散。
3加入20μl蛋白酶K和220μl裂解液MS，漩渦振蕩混勻。65℃溫浴10min。溶液應(yīng)變清亮，簡(jiǎn)短離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠。
4加入220μl無(wú)水乙醇，上下來(lái)回顛倒混勻。此時(shí)可能出現(xiàn)絮狀沉淀，將溶液及絮狀沉全部淀轉(zhuǎn)移到純化柱中。12,000 rpm離心1min，棄濾液。
5加入500μl去蛋白液PS。12,000 rpm離心1min，棄濾液。
6加入500μl漂洗液PE。12,000 rpm離心1min，棄濾液。
7加入500μl漂洗液PE。12,000 rpm離心1min，棄濾液。
8 12,000 rpm離心3min，以徹底去除純化柱中殘留的液體。
9將純化柱置于新的1.5 ml離心管中。向純化柱中央處，懸空滴加30-100μl洗脫液TE。室溫放置2min。
10 12,000 rpm離心2min，管底即為高純度基因組DNA。-20℃保存。
應(yīng)用[4][5]
用于鹿血的PCR-RFLP鑒定方法研究
建立鹿血PCR-RFLP（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)--限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性）種間及不同基原鑒定方法。尋找鹿血與非鹿血鑒別的限制性內(nèi)切酶,并確定鹿血中摻入其他常見(jiàn)動(dòng)物血的檢出限度。尋找鑒別梅花鹿與馬鹿血的限制性內(nèi)切酶,并確定梅花鹿血中加入馬鹿血的檢出限度。
方法:1.用三種不同的試劑盒提取樣品血液基因組DNA,測(cè)定濃度及純度,選擇適合提取本研究中動(dòng)物血液基因組DNA的試劑盒。
2. 用動(dòng)物DNA條形碼通用引物COI和cytb（細(xì)胞色素b）,擴(kuò)增樣品血液基因組DNA,以擴(kuò)增效率高、擴(kuò)增結(jié)果穩(wěn)定為指標(biāo)選取引物,并優(yōu)化擴(kuò)增條件。
3.試劑盒法純化PCR產(chǎn)物,T-A克?。ㄋ{(lán)白斑篩選及瓊脂糖凝膠電泳確定陽(yáng)性克隆）,菌液進(jìn)行基因序列測(cè)定。
4.采用軟件NEB Cutter2.0（http://nc2.neb.com/NEBcutter2/）對(duì)各樣品血液的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)分析,確定試驗(yàn)中所購(gòu)樣品均為正品。根據(jù)各樣品血液的cytb基因序列的差異,設(shè)計(jì)、選取可以區(qū)分鹿與非鹿、梅花鹿與馬鹿的DNA限制性內(nèi)切酶,并經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。
5.將提取的各樣品血液基因組DNA稀釋至相似濃度,且A260在0.11.0范圍內(nèi)。在梅花鹿血基因組DNA中分別加入不同體積分?jǐn)?shù)的非鹿類動(dòng)物血基因組DNA,在梅花鹿血基因組DNA中加入不同體積分?jǐn)?shù)的馬鹿血基因組DNA,經(jīng)PCR擴(kuò)增后,產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行切割,確定檢出限度。
參考文獻(xiàn)
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[5]鳳霞.鹿血的PCR-RFLP鑒定方法研究[D].承德醫(yī)學(xué)院,2018.