背景[1-3]
RV沙門菌增菌液體培養(yǎng)基英文全稱是Rappaport Vassiliadis Salmonella Enrichment Broth，簡稱RVSEB，主要用于控制菌檢查中沙門氏菌的選擇性增菌培養(yǎng)。在TSB復(fù)蘇培養(yǎng)后，取0.1ml加入10ml的RV沙門菌增菌液體培養(yǎng)基。
檢驗(yàn)原理：大豆蛋白胨在培養(yǎng)基中作為基礎(chǔ)營養(yǎng)物質(zhì)，為細(xì)菌的生長提供所需的碳源、氮源、維生素以及一些礦物質(zhì)等元素；氯化鎂提供必需的離子；氯化鈉維持均衡的滲透壓；磷酸鹽作為培養(yǎng)基的緩沖劑。孔雀綠能夠抑制非沙門氏菌的生長。
RV沙門菌增菌液體培養(yǎng)基效果圖
在RV沙門增菌液體培養(yǎng)基中，鼠傷沙門氏菌為渾濁；腸炎沙門氏菌為渾濁；
乙型副傷寒沙門菌為渾濁；大腸埃希氏菌為抑制或部分抑制；金黃色葡萄球菌為抑制。
成分(g/L)：大豆胨4.5；六水合氯化鎂29.0；氯化鈉8.0；磷酸氫二鉀0.4
磷酸二氫鉀0.6；孔雀綠0.036；pH值5.2±0.2 25℃。
用法：稱取本品27.1g，加熱攪拌溶解于1000ml純化水中，分裝試管，115℃高壓滅菌20分鐘，備用。
沙門菌是寄居在人類動(dòng)物腸道內(nèi)生化反應(yīng)和抗原構(gòu)造相似的革蘭陰性桿菌。它是一種腸道致病菌，常常因?yàn)檎`食不潔食物引起，感染者出現(xiàn)嚴(yán)重腹瀉。是人類食物中毒的主要病原之一。
由沙門氏菌引起的疾病主要分為兩大類：一類是傷寒和副傷寒，另一類是急性腸胃炎。其中鼠傷寒沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌、腸炎沙門氏菌等是污染動(dòng)物性產(chǎn)品，進(jìn)而引起人類沙門氏菌食物中毒的主要致病菌。
沙門氏菌污染主要來源于患病的人和動(dòng)物及其帶菌者，主要由其糞便、尿、乳汁以及流產(chǎn)胎兒、胎衣和羊水排出的病菌污染水源、土壤和飼料等，其中飼料和水源的污染是導(dǎo)致沙門氏菌傳染的主要原因。
應(yīng)用[4][5]
用于沙門氏菌、金黃色葡萄球菌及單增李斯特菌的同步快速檢測方法的研究
在本研究中,根據(jù)現(xiàn)有通用增菌液及選擇性增菌液,設(shè)計(jì)制備了一種能夠同時(shí)富集沙門氏菌、金黃色葡萄球菌及單增李斯特菌的復(fù)合增菌肉湯。
通過單因素實(shí)驗(yàn)挑選出合適添加劑,并采用響應(yīng)面分析對(duì)培養(yǎng)基成份進(jìn)行了優(yōu)化,最后得到SSL配方如下:胰蛋白胨17g/L、蛋白胨3g/L、磷酸二氫鉀2.5g/L、葡萄糖2.5g/L、丙酮酸鈉2.5g/L、甘露醇5g/L、氯化鈉15g/L、氯化鋰2g/L、亞碲酸鉀1mg/L、萘啶酮酸10mg/L。經(jīng)驗(yàn)證SSL可使得三種目標(biāo)菌以相對(duì)一致的速度進(jìn)行富集,經(jīng)過37℃150r/min振蕩培養(yǎng)24h后,菌體濃度到達(dá)107108CFU/mL,非目標(biāo)菌生長受到抑制。
針對(duì)沙門氏菌的invA基因,金黃色葡萄球菌的sa442基因及單增利斯特菌的hly基因成功設(shè)計(jì)了三對(duì)引物和三條特異性探針,進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增,并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行病原菌的液相芯片檢測。經(jīng)過優(yōu)化PCR產(chǎn)物與探針雜交的溫度,得到雜交條件為52℃,20min,檢測靈敏度可達(dá)100CFU/mL。
通過人工污染樣品的檢測和實(shí)際食品樣品的檢測,驗(yàn)證了SSL（S.enteritidis;S.aureus;L.monocytogens的復(fù)合增菌培養(yǎng)基）復(fù)合增菌技術(shù)及液相芯片檢測體系的檢測效果,預(yù)增菌及液相芯片檢測全過程可在24h內(nèi)完成,檢測靈敏度可達(dá)到10CFU/mL。
本研究所建立的液相芯片檢測方法在上述三種致病菌的快速和多重檢測上是可行的。結(jié)果表明其具備良好的重復(fù)性、特異性和靈敏性特點(diǎn)。與國標(biāo)法相比,檢測時(shí)間減少,準(zhǔn)確性提高,且可滿足多重檢測的要求。
參考文獻(xiàn)
[1]A multiplex RTi-PCR reaction for simultaneous detection of Escherichia coli O157:H7,Salmonella spp.and Staphylococcus aureus on fresh,minimally processed vegetables[J].Patricia Elizaquível,Rosa Aznar.Food Microbiology.2008(5)
[2]Improved multiplex immunoassay performance in human plasma and synovial fluid following removal of interfering heterophilic antibodies[J].Wilco de Jager,Berent J.Prakken,Johannes W.J.Bijlsma,Wietse Kuis,Ger T.Rijkers.Journal of Immunological Methods.2005(1)
[3]Application of a molecular beacon—real-time PCR technology to detect Salmonella species contaminating fruits and vegetables[J].Samantha Hu Liming,Arvind A Bhagwat.International Journal of Food Microbiology.2004(2)
[4]Comparison of selective and nonselective primary enrichments for the detection of Listeria monocytogenes in cheese[J].Nancy Rijpens,Lieve Herman.International Journal of Food Microbiology.2004(1)
[5]劉園園.沙門氏菌、金黃色葡萄球菌及單增李斯特菌的同步快速檢測方法的研究[D].華南理工大學(xué),2010.