桃兒七（Sinopodophyllum hexandrum (Royle) Ying） 是小檗科桃兒七屬多年生草本植物，植株高20-50厘米早在 1992 年桃兒七就被《中國植物紅皮書》收錄。“桃兒七”屬于“太白七藥”之一，具有神奇的抗癌作用，其根和根莖中含有大量的具有抗癌活性的木脂素類物質(zhì)，其中鬼臼毒素 (podophyllotoxin) 抗癌活性最高，是合成GP7，VP216(etoposide) 和 VM 226 (teniposide) 等抗癌藥物的起始物。由于根狀莖與果實(shí)入藥，而被任意采挖，天然繁殖能力較弱，隨著植被的破壞而導(dǎo)致其生長環(huán)境的改變，植株日益稀少，分布區(qū)日漸縮減。

目前許多臨床藥物是通過天然的植物代謝物合成的，但是只有一小部分植物代謝物的合成通路是已知的，這就成為這些天然代謝物的批量化生產(chǎn)的限制條件。鬼臼毒素是一種木酚素，是抗腫瘤藥物依托泊苷的前體，本身并沒有拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑功能，但經(jīng)過一系列化學(xué)修飾后形成的依托泊甙具有拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑活性，能夠發(fā)揮抗腫瘤作用，合成通路只有部分是已知的，目前只能依靠天然的植物產(chǎn)生的代謝物合成依托泊苷。因此，完整的鬼臼毒素的合成通路將有助于幫助依托泊苷的工廠化生產(chǎn)。

研究材料：物理損傷的離體桃兒七的健壯葉片

技術(shù)平臺(tái)：LC-MS，RNA-seq，轉(zhuǎn)基因

方案設(shè)計(jì)：

1）利用LC-MS檢測方法，檢測物理損傷后不同時(shí)間的桃兒七種鬼臼毒素的含量，發(fā)現(xiàn)葉片受傷后在12，24h后鬼臼毒素含量達(dá)到；

2）根據(jù)LC-MS檢測結(jié)果，對(duì)桃兒七葉片進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，取樣時(shí)間0，3，9，12h，每個(gè)樣品三個(gè)重復(fù)，根據(jù)轉(zhuǎn)錄組信息及公共數(shù)據(jù)篩選與鬼臼毒素合成相關(guān)的基因；

3）利用轉(zhuǎn)基因的方法，將候選基因轉(zhuǎn)到煙草葉片中，并利用LC-MS方法檢測煙草葉片中代謝物含量的變化，找到鬼臼毒素合成通路的調(diào)控基因。

研究結(jié)果：

在鬼臼毒素的生物合成通路中，前期的基因是已知的。如圖1所示，DIR，PLR，SDH，CYP719A23這4個(gè)鬼臼毒素合成相關(guān)的前期基因是已知的。后期基因及中間代謝物通路不清楚，但是合成通路中的已知亞太因（yatein）和去氧鬼臼毒素（deoxypodophyllotoxin）以及鬼臼毒素是已知的。作者利用公共數(shù)據(jù)庫中的桃兒七鬼臼毒素相關(guān)轉(zhuǎn)錄組信息進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，DIR，PLR，SDH，CYP719A23這4個(gè)基因都是高表達(dá)的。選擇公共數(shù)據(jù)庫中與已知基因具有相似表達(dá)的候選基因，篩選到4個(gè)O-甲基轉(zhuǎn)移酶（OMT1-4）基因，12個(gè)細(xì)胞色素P450（CYP）基因和2個(gè)氧代戊二酸/ Fe（II）-依賴性雙加氧酶（2-ODD）基因。

下一步作者利用代謝組及轉(zhuǎn)基因的方法進(jìn)行基因的驗(yàn)證。用含有羅漢松樹脂酚（（-）-matairesinol）培養(yǎng)基培養(yǎng)煙草離體葉片，將上文中預(yù)測到的基因分別與CYP719A23轉(zhuǎn)到煙草葉片中。利用LC-MS方法檢測轉(zhuǎn)入以上基因1d后葉片，發(fā)現(xiàn)只有轉(zhuǎn)入OMT3基因的葉片中pluviatolide被大量消耗，說明OMT3控制合成pluviatolide的下一個(gè)產(chǎn)物，經(jīng)解譜分析，產(chǎn)物為（-）-5’-desmethoxy-yatein。將剩余的候選基因分別與CYP719A23和OMT3轉(zhuǎn)入到含有羅漢松樹脂酚（（-）-matairesinol）培養(yǎng)基培養(yǎng)煙草離體葉片，經(jīng)LC-MS檢測并未發(fā)現(xiàn)（-）-5’-desmethoxy-yatein的消耗。

作者前期的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，損傷桃兒七葉片后鬼臼毒素的含量急劇升高，利用LC-MS檢測發(fā)現(xiàn)鬼臼毒素及其前體物質(zhì)在12,24h含量達(dá)到最高。利用RT-PCR驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)與鬼臼毒素合成相關(guān)的前期5個(gè)基因表達(dá)量在9h達(dá)到最高（圖2）。

圖2 物理損傷后已知鬼臼毒素合成基因RT-PCR結(jié)果

根據(jù)已知的結(jié)果，作者對(duì)受傷的桃兒七葉片進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，處理時(shí)間為受傷后0，3，9，12h，每個(gè)處理三個(gè)重復(fù)，共12個(gè)樣品。對(duì)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，根據(jù)推測鬼臼毒素合成需要用到的酶有四種，分別為O-甲基轉(zhuǎn)移酶（O-methyltransferase，OMT），細(xì)胞色素P450（cytochromes P450，CYP），2-氧化戊二酸/Fe(II)依賴的雙加氧酶（2-oxoglutarate/Fe(II)-dependent dioxygenase，2-ODD），以及多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO），通過尋找與這四種酶家族同源的基因找到，336個(gè)，對(duì)這336個(gè)基因進(jìn)行層次聚類分析得到91個(gè)表達(dá)模式相同的基因，對(duì)91個(gè)基因進(jìn)行表達(dá)量分析，找到22個(gè)高表達(dá)基因，這22個(gè)基因中包含有7個(gè)具有已知酶功能的基因，其中一個(gè)基因?yàn)镺MT3（圖3）。

圖3 22個(gè)高表達(dá)基因的聚類圖

標(biāo)黑的為已知鬼臼毒素合成基因，紅色為篩選的7條候選基因

下一步作者的工作是對(duì)這6條候選基因進(jìn)行驗(yàn)證如圖4所示。6個(gè)候選基因分別與CYP719A23和OMT3轉(zhuǎn)移到用含有(-)-matairesinol培養(yǎng)基培養(yǎng)4d后煙草葉片中去，1d后利用LC-MS方法檢測鬼臼毒素合成相關(guān)代謝物含量。通過對(duì)含有6種候選基因葉片的LC-MS比較分析，發(fā)現(xiàn)在含有CYP71CU1基因的Phex524樣品中觀察到(-)-5’-desmethoxy-yatein（5’去甲氧基亞太因）含量的變化，并通過質(zhì)譜鑒定發(fā)現(xiàn)了一個(gè)高含量的物質(zhì)，為(-)-5’-desmethyl-yatein（5’去甲基亞太因）。為了完成(-)-yatein（合成鬼臼毒素的中間產(chǎn)物）的合成通路，將剩余的5個(gè)基因與CYP719A23,OMT3,和CYP71CU1，分別轉(zhuǎn)移到含有(-)-matairesinol培養(yǎng)基培養(yǎng)煙草葉片中去。對(duì)這些葉片進(jìn)行LC-MS分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)含有OMT1基因的葉片未檢測到(-)-5’-desmethoxy-yatein（5’去甲氧基亞太因），但是檢測到了(-)-yatein（亞太因）的高表達(dá)，說明OMT1基因誘導(dǎo)(-)-5’-desmethyl-yatein（5’去甲基亞太因）產(chǎn)生(-)-yatein(亞太因)。在yatein（亞太因）到deoxy-podophyllotoxin（脫氧鬼臼毒素）的合成路徑中，涉及到了芳基四氫萘骨架中的中心六元環(huán)閉合和氧化修飾。在上一步的試驗(yàn)中，檢測到了含有2-ODD的樣品中的(-)-5’-desmethoxy-yatein（5’去甲氧基亞太因）大量消耗，對(duì)應(yīng)產(chǎn)生了5’-desmethoxy-deoxy-podophyllotoxin（5’去甲基脫氧鬼臼毒素）。我們假設(shè)反應(yīng)機(jī)制涉及通過羥基化，隨后脫水和碳-碳鍵形成活化7’碳，通過醌甲基化物中間體形成。因此假設(shè)2-ODD可以將yatein（亞太因）合成到(-)-deoxy-podophyllotoxin（脫氧鬼臼毒素）。于是作者將2-ODD，CYP719A23，OMT3，CYP71CU1和OMT1一起轉(zhuǎn)移到煙草葉片中，經(jīng)過LC-MS檢測發(fā)現(xiàn)葉片中yatein（亞太因）被大量消耗而(-)-deoxy-podophyllotoxin（脫氧鬼臼毒素）含量增加，因此可以確定2-ODD基因可以促進(jìn)生成(–)-deoxy-podophyllotoxin。為了驗(yàn)證(-)-deoxy-podophyllotoxin（脫氧鬼臼毒素）到podophyllotoxin（鬼臼毒素）生物合成通路，將公共數(shù)據(jù)庫里6個(gè)CYP候選基因分別于其他幾個(gè)已經(jīng)確定的基因轉(zhuǎn)移到煙草葉片中，經(jīng)過LC-MS分析發(fā)現(xiàn)，6種類型的葉片均未發(fā)現(xiàn)podophyllotoxin（鬼臼毒素）合成，但是意外的是作者發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移CYP71BE54基因的葉片(-)-deoxy-podophyllotoxin（脫氧鬼臼毒素）被大量消耗，而檢測到大量的(-)-4’-desmethyl-deoxy-podophyllotoxin（4’去甲基脫氧鬼臼毒素）。在篩選其他的基因是發(fā)現(xiàn)CYP82D61能夠使得 (-)-4’-desmethyl-deoxy-podophyllotoxin（去甲基脫氧鬼臼毒素）大量消耗，得到(–)-desmethyl-epipodophyllotoxin（去甲基表鬼臼毒素）。雖然沒有產(chǎn)生podophyllotoxin（鬼臼毒素）但是產(chǎn)生了podophyllotoxin（鬼臼毒素）的差異構(gòu)象體（表鬼臼毒素）。而表鬼臼毒素與抗癌藥物依托泊甙結(jié)構(gòu)更相近，僅需一步化學(xué)修飾就可以合成依托泊甙。

圖4 轉(zhuǎn)入相應(yīng)基因后matairesinol培養(yǎng)基內(nèi)煙草葉片中鬼臼毒素中間代謝物的含量

為了驗(yàn)證整個(gè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，作者將10個(gè)基因一起轉(zhuǎn)入到含有（+）-pimoresinol的培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)，并利用LC-MS檢測鬼臼毒素合成通路代謝物含量，結(jié)果中發(fā)現(xiàn)了(–)-4′-desmethylepipodophyllotoxin（4’去甲氧基表鬼臼毒素），而其他對(duì)照試驗(yàn)，只轉(zhuǎn)入10個(gè)基因，或轉(zhuǎn)入GFP+（+）-pimoresinol的均為檢測到(–)-4′-desmethylepipodophyllotoxin（4’去甲氧基表鬼臼毒素）的生成如圖5。

圖5  B 不同條件處理下的煙草葉片LC-MC提取離子流圖（箭頭代表(–)-4′-desmethylepipodophyllotoxin糖苷配基）C 不同處理?xiàng)l件下檢測到的 (–)-4′-desmethylepipodophyllotoxin含量

最終，作者完成了鬼臼毒素完整的合成通路，并且實(shí)現(xiàn)了體外煙草中鬼臼毒素的合成。