背景

糖尿病是一種常見的內(nèi)分泌疾病，會(huì)導(dǎo)致許多危險(xiǎn)的并發(fā)癥，包括糖尿病腎病(DN)。DN是世界范圍內(nèi)終末期腎病(ESRD)的主要病因之一，其特點(diǎn)是以微量白蛋白尿?yàn)樽钤绲呐R床表現(xiàn)。DN早期主要是一種腎小球疾病，足細(xì)胞丟失多見于DN患者，DN中足細(xì)胞丟失與蛋白尿存在相關(guān)性。

足細(xì)胞是高度特化的終末分化的內(nèi)臟上皮細(xì)胞，覆蓋在腎小球基底膜表面，構(gòu)成腎小球?yàn)V過屏障，在維持腎小球選擇性濾過中發(fā)揮關(guān)鍵作用。越來越多的證據(jù)表明足細(xì)胞損傷是DN的主要危險(xiǎn)因素之一，減輕足細(xì)胞損傷可以改善DN。但目前缺乏有效的治療藥物來減輕足細(xì)胞損傷。
高糖處理顯著降低了細(xì)胞存活率，增加了凋亡細(xì)胞的百分比。足細(xì)胞暴露于高糖會(huì)導(dǎo)致炎癥。

梓醇是一種天然環(huán)烯醚萜苷，是從長期用于中藥的地黃中提取的主要活性成分。據(jù)報(bào)道，梓醇具有廣泛的藥理活性，包括抗DN。先前的一些研究表明梓醇可以改善腎功能，減少蛋白尿，這與DN的足細(xì)胞損傷密切相關(guān)。然而，梓醇是否對(duì)DN的足細(xì)胞損傷有保護(hù)作用仍不清楚。梓醇的抗凋亡作用已經(jīng)在幾個(gè)模型中得到證實(shí)。梓醇可通過抑制人單核細(xì)胞THP-1細(xì)胞的NADPH氧化酶活性來抑制AGE誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生。

NOX4是一種與糖尿病相關(guān)的關(guān)鍵酶，已知在各種條件下會(huì)增加足細(xì)胞中的ROS水平。依賴NOX4的ROS產(chǎn)生誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡，這在DN條件下的足細(xì)胞損傷中觀察到。

活性氧(ROS)是正常代謝和異物暴露的產(chǎn)物，是DN發(fā)病的主要因素，對(duì)足細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)起著至關(guān)重要的作用。已經(jīng)證實(shí)在DN的足細(xì)胞中ROS過度產(chǎn)生。
細(xì)胞凋亡是細(xì)胞死亡的一個(gè)嚴(yán)格控制的過程，是生物體發(fā)育和典型細(xì)胞生長所必需的，在體內(nèi)和體外DN模型中都觀察到足細(xì)胞凋亡。Bax和Bcl-2是固有凋亡反應(yīng)的關(guān)鍵介質(zhì)，Bax刺激細(xì)胞凋亡，Bcl-2抑制細(xì)胞凋亡。通常用Bcl-2/Bax的比值來評(píng)價(jià)細(xì)胞凋亡的程度，當(dāng)該比值降低時(shí)，表明細(xì)胞凋亡受到刺激。
受ROS調(diào)控的p38MAPK/NF-κB信號(hào)通路在細(xì)胞凋亡和炎癥中起重要作用。ROS下游的促凋亡信號(hào)因子p38MAPK的激活導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。過量的ROS可以激活促凋亡的p38MAPK信號(hào)通路，這與DN的足細(xì)胞損傷和蛋白尿有關(guān)。NFκB是參與DN進(jìn)展的重要轉(zhuǎn)錄因子，也是p38MAPK活化的重要下游轉(zhuǎn)錄因子。
TLR4/MyD88信號(hào)通路在體內(nèi)和體外DN模型足細(xì)胞損傷的炎癥反應(yīng)中起重要作用，TLR4基因敲除被證明可以減輕高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷中細(xì)胞凋亡的增加。TLR4可以招募MyD88，在足細(xì)胞損傷中還可以激活NF-κB信號(hào)通路和細(xì)胞因子的產(chǎn)生。

目的

本研究采用高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷模型，探討梓醇對(duì)高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制。

方法

細(xì)胞培養(yǎng)

MTT  檢測(cè)細(xì)胞活力

乳酸脫氫酶評(píng)估  檢測(cè)細(xì)胞活力

流式細(xì)胞儀檢測(cè)

二氯熒光素法  檢測(cè)ROS（氧化應(yīng)激）

Annexin V/PI染色  檢測(cè)凋亡

SOD和MDA  測(cè)定氧化應(yīng)激

ELISA  檢測(cè)足細(xì)胞炎癥細(xì)胞因子水平

免疫熒光染色  檢測(cè)凋亡

免疫印跡  檢測(cè)蛋白表達(dá)  

結(jié)果及討論

梓醇能逆轉(zhuǎn)高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷。研究中，高糖降低足細(xì)胞Bcl-2/Bax的比值，導(dǎo)致足細(xì)胞凋亡，梓醇升高足細(xì)胞Bcl-2/Bax的比值，表明梓醇對(duì)凋亡有很大的阻斷作用。高糖可促進(jìn)促炎細(xì)胞因子IL-1β、T N F-α和IL-6的分泌，梓醇可逆轉(zhuǎn)這一作用。研究中，高糖增加了NOX4的表達(dá)和細(xì)胞內(nèi)ROS水平，梓醇可緩解NOX4和ROS的升高。這些結(jié)果為梓醇拮抗高糖誘導(dǎo)的ROS生成提供了證據(jù)，表明梓醇對(duì)高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷的抗凋亡和抗炎作用與其抗氧化作用有關(guān)。
研究中，雖然對(duì)照組和高糖處理的足細(xì)胞中p38MAPK的表達(dá)沒有差異，但高糖處理的足細(xì)胞中p38MAPK的磷酸化明顯高于對(duì)照組處理的足細(xì)胞，這種磷酸化被梓醇逆轉(zhuǎn)。該研究中，高糖處理的足細(xì)胞的p-I Bα和NF-κB的核轉(zhuǎn)位明顯高于對(duì)照組處理的足細(xì)胞，而梓醇可抑制這兩種作用。這些結(jié)果表明梓醇可以抑制高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷中的p38MAPK/NF-κB信號(hào)通路，這與梓醇的抗凋亡和抗炎作用有關(guān)。

研究中，TLR4/MyD88信號(hào)通路被激活，在高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷中觀察到細(xì)胞因子的產(chǎn)生，這與一些研究的結(jié)果一致。梓醇可顯著下調(diào)TLR4和MYD88的表達(dá)，從而阻止I-κBα磷酸化和降解，可能抑制NF-κB移位到細(xì)胞核內(nèi)，從而抑制炎癥反應(yīng)的激活。

總結(jié)

本研究證實(shí)梓醇對(duì)高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷具有抗凋亡和抗炎作用。這些作用可能與抑制NOX4,減輕活性氧生成，抑制TLR4/MyD88和p38MAPK信號(hào)通路，阻止NF-κB活化和移位有關(guān)。因此梓醇有望成為治療糖尿病腎病足細(xì)胞損傷的有效藥物。

研究思路 

MTT試驗(yàn)和LDH釋放實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞活力顯著提，即梓醇對(duì)高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞有保護(hù)作用。在為確定梓醇對(duì)高糖條件下足細(xì)胞抗氧化酶活性的影響，我們測(cè)定了SOD活性和MDA水平。此外，我們接下來評(píng)估了用DCFH-DA染色的足細(xì)胞中ROS的產(chǎn)生發(fā)現(xiàn)梓醇可抑制高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞ROS生成。為了評(píng)估高糖對(duì)ROS生成酶表達(dá)的可能影響，我們分析了已知在不同條件下增加足細(xì)胞ROS水平的與糖尿病相關(guān)的關(guān)鍵酶NOX4的表達(dá)。為了闡明梓醇的保護(hù)作用是否與減少凋亡有關(guān)，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)足細(xì)胞凋亡。高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷總是與炎癥相關(guān)。為探討梓醇的抗炎作用，我們用ELISA法檢測(cè)了高糖處理組大鼠足細(xì)胞IL-1β、IL-6和TNF-α的水平。TLR4/MyD88信號(hào)通路在足細(xì)胞損傷中起重要作用。由于ROS可以通過p38MAPK/NF-κB信號(hào)通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，我們分析了p38MAPK和IκBα的表達(dá)及其磷酸化。此外，該研究還做了免疫熒光染色研究發(fā)現(xiàn)高糖顯著增加NFκB向細(xì)胞核的易位而梓醇逆轉(zhuǎn)了這一作用。

References:

Chen, Y., et al., The protective effect and mechanism of catalpol on high glucose-induced podocyte injury. BMC Complementary and Alternative Medicine, 2019. 19(1).