背景^[1-3]

考馬斯亮藍(lán)染色試劑盒(常規(guī)法)采用了最經(jīng)典的考馬斯亮藍(lán)染色和脫色方法，以考馬斯亮藍(lán)R250為染料，可用于SDS-PAGE或非變性PAGE等蛋白電泳凝膠的常規(guī)染色和脫色，或Western轉(zhuǎn)膜后PAGE膠上殘余蛋白的檢測(cè)。

使用考馬斯亮藍(lán)染色試劑盒，采用常規(guī)染色脫色方法累計(jì)時(shí)間達(dá)到2-3小時(shí)后可以觀察到蛋白條帶；采用快速染色脫色方法20分鐘左右即可觀察到蛋白條帶。觀察到最清晰的蛋白條帶則需染色脫色更長(zhǎng)時(shí)間。

考馬斯亮藍(lán)染色試劑盒中的染色液和脫色液經(jīng)過改良，不含有毒的甲醇，但含有刺激性氣味的乙酸。

使用方法：

1.電泳結(jié)束后，取凝膠放入適量考馬斯亮藍(lán)染色液中，確保染色液可以充分覆蓋凝膠。

2.置于水平搖床或側(cè)擺搖床上緩慢搖動(dòng)，室溫染色1小時(shí)或更長(zhǎng)時(shí)間。

3.倒出染色液。染色液可以回收重復(fù)使用至少2-3次。

4.加入適量脫色液，確保脫色液可以充分覆蓋凝膠。

5.置于水平搖床或側(cè)擺搖床上緩慢搖動(dòng)，室溫脫色4-24小時(shí)。期間更換脫色液2-4次，直至藍(lán)色背景基本上全部被脫去，并且蛋白條帶染色效果達(dá)到預(yù)期。通常蛋白條帶在脫色1-2小時(shí)后即可出現(xiàn)。

6．完成脫色后，可以把凝膠保存在水中，用于后續(xù)的拍照等。保存在水中的凝膠會(huì)發(fā)生溶漲。如需避免溶漲，可以把膠保存在含20%甘油的水中。長(zhǎng)期保存可以制備干膠。

應(yīng)用^[4][5]

用于骨炎定對(duì)體外培養(yǎng)軟骨細(xì)胞的影響研究

采用軟骨細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)觀察其對(duì)軟骨細(xì)胞代謝的影響。

關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的分離和培養(yǎng)采用膠原酶Ⅱ分段酶消化法從三月齡大耳白兔的關(guān)節(jié)軟骨中分離出軟骨細(xì)胞并進(jìn)行原代和傳代培養(yǎng)。每日在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及其生長(zhǎng)情況，并用甲苯胺藍(lán)異染色法進(jìn)行細(xì)胞表型鑒定。

結(jié)果表明，軟骨細(xì)胞形成單層的時(shí)間原代培養(yǎng)1周左右，傳代培養(yǎng)約4-5天，細(xì)胞以圓形或上皮樣細(xì)胞形態(tài)為主。甲苯胺藍(lán)染色證實(shí)，細(xì)胞可合成蛋白多糖，異染反應(yīng)主要集中在細(xì)胞集落樣生長(zhǎng)區(qū)，異染程度以原代培養(yǎng)最為顯著。

骨炎定對(duì)培養(yǎng)兔軟骨細(xì)胞增殖和蛋白質(zhì)合成的影響把傳一代的軟骨細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板和24孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24小時(shí)后細(xì)胞貼壁進(jìn)行分組試驗(yàn)。

1 MTT法測(cè)細(xì)胞增殖把96孔培養(yǎng)板中的32孔隨機(jī)分為8組，每組4孔，每孔培養(yǎng)體積0.1ml。A組（對(duì)照組）加用5％血清培養(yǎng)液；B-G組：分別加用含有5％血清與1.25％、2.5％、5％、10％、20％、40％DMEM培養(yǎng)液；AO組為空白調(diào)零組，未接種細(xì)胞，只加有含有5％血清的DMEM在培養(yǎng)48小時(shí)后用MIT ie檢測(cè)細(xì)胞活性和增殖。結(jié)果GYD組5O、10o、20％骨炎定可促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖，與對(duì)照組相比，差別有非常顯著意義。

2考馬斯亮藍(lán)祛檢測(cè)細(xì)胞總蛋白24孔培養(yǎng)板隨機(jī)分為六組，每組4孔，分別為：A組：空白對(duì)照組。只加含有5％血清培養(yǎng)液；BS組分別加含有20％、10％、5％骨炎定、5％防風(fēng)、5％當(dāng)歸注射液的培養(yǎng)液，培養(yǎng)三天后用考馬斯亮藍(lán)法檢測(cè)細(xì)胞總蛋白。結(jié)果表明：5％、10％、20％可促進(jìn)軟骨細(xì)胞總蛋白合成，與對(duì)照組相比差別有非常顯著性意義。

參考文獻(xiàn)

[1]Osteogenic protein-1（OP-1）blocks cartilage damage caused by fibronectin fragments and promotes repair by enhancing proteoglycan synthesis[J].H.E.Koepp,K.T.Sampath,K.E.Kuettner,G.A.Homandberg.Inflammation Research.1999(4)

[2]Microgravity tissue engineering[J].Lisa E.Freed,Gordana Vunjak-Novakovic.In Vitro Cellular&Developmental Biology-Animal.1997(5)

[3]Differentiation and mineralization in chick chondrocytes maintained in a high cell density culture:A model for endochondral ossification[J].Colin Farquharson,Colin C.Whitehead.In Vitro Cellular&Developmental Biology-Animal.1995(4)

[4]1992 ALZA distinguished lecture:Bioengineering and vascular biology[J].Larry V.McIntire.Annals of Biomedical Engineering.1994(1)

[5]楊運(yùn)東.骨炎定對(duì)體外培養(yǎng)軟骨細(xì)胞的影響[D].廣州中醫(yī)藥大學(xué),2001.