背景[1-3]
Anti-GAPDH抗體是以ANTI-GAPDH為抗原制得的免疫抗體，可以特異性結(jié)合GAPDH。主要用于檢測GAPDH的Western Blot、IHC-P、IF、ELISA、Co-IP等多種免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)。
甘油酸-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)是生物體內(nèi)一類十分保守的重要多功能酶類，廣泛存在于原核及真核生物體內(nèi)，如大腸桿菌、酵母、秀麗線蟲、大鼠和小鼠等模式生物，主要參與生物體內(nèi)糖代謝中糖酵解的第六步反應(yīng)，即催化甘油醛-3-磷酸轉(zhuǎn)化為1,3-二磷酸甘油酸并釋放出能量(ATP)的過程。
生物界中GAPDH單體分子量大小在30kD-40kD之間，天然狀態(tài)的GAPDH主要以四聚體形式存在，其氨基酸編碼序列在原核及真核生物體內(nèi)均高度保守，同源性高達(dá)76%。原核及真核生物體內(nèi)GAPDH蛋白是一類功能上十分保守的重要蛋白酶超家族，在不同的物種中分別由不同的基因編碼，如微生物的gapA,gapB和gapC基因、酵母菌的TDH-1,TDH-2和TDH-3基因、秀麗線蟲的gpd-1,gpd-2,gpd-3和gpd-4基因、大鼠的G3PDH基因等。
不同物種中多種編碼基因的存在一方面提示了不同GAPDH變體之間的功能代償性，另一方面反映了個體應(yīng)對環(huán)境壓力的高度可調(diào)控性，為其作為管家蛋白的功能保守性提供了重要依據(jù)。內(nèi)標(biāo)蛋白是生物體內(nèi)一類重要的管家蛋白，具有序列保守性高、組織分布廣等特點(diǎn)。目如常見的內(nèi)標(biāo)蛋白主要包括：細(xì)胞骨架蛋白肌動蛋白actin、微管蛋白Tubulin、細(xì)胞代謝相關(guān)蛋白GAPDH等。
其中，GAPDH在同種細(xì)胞或組織中的蛋白表達(dá)量相對恒定，且很少受外部應(yīng)激因素的影響，已被廣泛用作RT-PCR和Western blot等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化的內(nèi)參分子，特別是其作為內(nèi)標(biāo)蛋白在組織或細(xì)胞內(nèi)蛋白相對表達(dá)定量中的應(yīng)用。
應(yīng)用[4][5]
用于GAPDH作為原核及真核生物通用型內(nèi)標(biāo)蛋白的研究及相關(guān)生物技術(shù)研發(fā)研究
利用鼠源GAPDH單克隆抗體分別檢測了正常條件下大腸桿菌(包括BL21(DE3)，HB101，DH5a禾口OP50四個株系)、酵母菌GS115、秀麗線蟲、PC12細(xì)胞、小鼠腦組織和大鼠腦組織中GAPDH蛋白的表達(dá)情況，進(jìn)而分別檢測了大腸桿菌BL21(DE3)、酵母菌GS115、秀麗線蟲和PC12細(xì)胞在不同應(yīng)激條件下GAPDH蛋白的表達(dá)變化。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)，鼠源GAPDH單克隆抗體可廣泛地識別不同物種GAPDH蛋白，且不同物種GAPDH的含量及分子量存在明顯差異，原核生物中GAPDH分子量明顯低于真核生物。同時，不同物種GAPDH可相對穩(wěn)定地表達(dá)在不同的外界應(yīng)激條件下，如大腸桿菌GAPDH的表達(dá)不隨誘導(dǎo)劑IPTG濃度的增加而改變，也不隨誘導(dǎo)表達(dá)時間的增加而變化；酵母菌GS115中GAPDH的表達(dá)不隨誘導(dǎo)劑甲醇濃度的增加而改變，也不隨誘導(dǎo)表達(dá)時間的增加而變化；秀麗線蟲中GAPDH的表達(dá)不隨百草枯(Paraquat,PQ)處理濃度的增加而變化；PC12細(xì)胞中GAPDH的表達(dá)不隨亞硫酸鈉(Sodium sulfite,SS)處理濃度的增加而改變。
上述結(jié)果說明GAPDH可廣泛且穩(wěn)定地表達(dá)于原核及真核生物，可用于原核及真核生物蛋白表達(dá)相對定量的內(nèi)標(biāo)蛋白。進(jìn)一步地，為了明確鼠源GAPDH單克隆抗體能識別原核生物GAPDH變體類型，采用免疫共沉淀技術(shù)獲得大腸桿菌HB101與鼠源GAPDH單克隆抗體相互作用的蛋白，進(jìn)而利用MALDI-TOF-MS質(zhì)譜鑒定及Mascot多肽指紋圖譜分析比對。
參考文獻(xiàn)
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[5]吳永紅.GAPDH作為原核及真核生物通用型內(nèi)標(biāo)蛋白的研究及相關(guān)生物技術(shù)研發(fā)[D].中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院,2013.