背景[1-3]
Anti-NeuN(rabbit polyclonal)是以Anti-NeuN為抗原的多克隆抗體,可以特異性結(jié)合Anti-NeuN。Anti-NeuN(rabbit polyclonal)主要用于ICC/IF,Dotblot,ELISA,IHC-P,IHC-Fr,Immunomicroscopy,WB等Anti-NeuN檢測實(shí)驗(yàn)。
抗原與抗體能夠特異性結(jié)合是基于抗原決定簇(表位)和抗體超變區(qū)分子間的結(jié)構(gòu)互補(bǔ)性與親和性。這種特性是由抗原、抗體分子空間構(gòu)型所決定的。除兩者分子構(gòu)型高度互補(bǔ)外,抗原表位和抗體超變區(qū)必須密切接觸,才有足夠的結(jié)合力。
抗神經(jīng)元核抗體分為1型和2型,1型又稱為Hu抗體,2型又稱為Ri抗體。Hu的靶抗原存在于中樞及外周神經(jīng)系統(tǒng)的所有神經(jīng)元,也存在于相關(guān)腫瘤細(xì)胞內(nèi)。Ri的靶抗原局限于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元。
未發(fā)現(xiàn)正常人存在抗神經(jīng)元核抗體。Hu抗體比Ri抗體常見。臨床上常用間接免疫熒光法測定抗神經(jīng)元核抗體。間接免疫熒光法實(shí)驗(yàn)原理將熒光素標(biāo)記在相應(yīng)的抗體上,直接與相應(yīng)抗原反應(yīng)。
步,用未知未標(biāo)記的抗體(待檢標(biāo)本)加到已知抗原標(biāo)本上,在濕盒中37℃保溫30min,使抗原抗體充分結(jié)合,然后洗滌,除去未結(jié)合的抗體。
第二步,加上熒光標(biāo)記的抗球蛋白抗體或抗IgG、IgM抗體。如果步發(fā)生了抗原抗體反應(yīng),標(biāo)記的抗球蛋白抗體就會(huì)和已結(jié)合抗原的抗體進(jìn)一步結(jié)合,從而可鑒定未知抗體。
應(yīng)用[4][5]
用于ERK-TRPV4通路在大鼠背根神經(jīng)節(jié)持續(xù)受壓致痛覺敏感中的作用機(jī)制研究
取實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為5組,分別給予生理鹽水、shRNA 10^4病毒單位(toxic units,TU)、10^5 TU、10^6 TU和10^7 TU,每組各位6只大鼠。各組中,每只大鼠鞘內(nèi)注射體積均為10uL,連續(xù)注射3天。自第1天注射開始計(jì)算,第5天時(shí),生理鹽水心臟灌注后取材。隨后利用Western Blot及RT-qPCR的方法,進(jìn)行檢測并評(píng)價(jià)慢病毒鞘內(nèi)注射的效果從而確定慢病毒的注射滴度。
蛋白印記法測定CCD后DRG及脊髓背角組織中的蛋白表達(dá)手術(shù)側(cè)L4及L5背根神經(jīng)節(jié)以及相應(yīng)節(jié)段的脊髓背角,提取總蛋白。SDS-PAGE凝膠電泳法使蛋白分離,轉(zhuǎn)印蛋白至PVDF膜,室溫封閉、一抗及二抗孵育后顯影。檢測鞘內(nèi)注射慢病毒干擾ERK后,DRG及脊髓背角組織中TRPV4、ERK及P-ERK蛋白表達(dá)變化。
實(shí)時(shí)定量熒光PCR測定DRG及脊髓背角組織中mRNA的表達(dá)變化手術(shù)側(cè)L4及L5背根神經(jīng)節(jié)及相應(yīng)節(jié)段的脊髓背角,快速取材,提取總RNA,測定濃度。利用Real-time quantitative PCR檢測DRG及脊髓背角組織中TRPV4、ERK1及ERK2的mRNA表達(dá)變化。各指標(biāo)的引物序列同部分。
免疫共沉淀使用IP-WB裂解液,提取DRG和脊髓背角的組織總蛋白后,采用Prorein A-argarose方法,分別用anti-TRPV4抗體和anti-ERK抗體與之反應(yīng),進(jìn)行免疫共沉淀結(jié)合。沉淀后的復(fù)合物利用蛋白印記法進(jìn)行分析,分別觀察各組中是否存在所需目的蛋白。
脊髓和DRG的免疫組織化學(xué)染色一抗為:anti-NeuN多克隆抗體(小鼠抗大鼠,1:300,Abcam,USA);anti-ERK多克隆抗體(兔抗大鼠,1:500,CST,USA);anti-P-ERK多克隆抗體(兔抗大鼠,1:200,CST,USA);anti-TRPV4多克隆抗體(兔抗大鼠,1:200,Abcam,USA)。二抗為:辣根過氧化物酶標(biāo)記-山羊抗小鼠IgG、辣根過氧化物酶標(biāo)記-山羊抗兔IgG(北京義翹神州科技有限公司)。經(jīng)DAB顯染色和蘇木素染核后,觀察目的蛋白的組織定位。
參考文獻(xiàn)
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