背景[1-3]
GENOMEPLEX單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增試劑盒是用于從單細(xì)胞(或數(shù)個細(xì)胞)中制備和擴(kuò)增全基因組的試劑盒。它是整合單細(xì)胞裂解液和全基因組擴(kuò)增試劑盒而成。GENOMEPLEX單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增試劑盒利用了Sigma一項(xiàng)專利技術(shù),該技術(shù)基于基因組DNA隨機(jī)片段化的原理,所得的小片段轉(zhuǎn)化為兩側(cè)含有通用引物位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增文庫分子。WGA通過通用寡核苷酸引物進(jìn)行的文庫分子PCR擴(kuò)增實(shí)現(xiàn)。每個細(xì)胞都是獨(dú)一無二的–它占據(jù)了獨(dú)特的空間位置,它的復(fù)制基因組中攜帶了獨(dú)特的錯誤。目前多種新型分析技術(shù),如NGS,都是為細(xì)胞群體而設(shè)計(jì)的,需要一定的樣本量。對于一些特殊樣本或應(yīng)用,如CTC或PGS/PGD應(yīng)用等,它們需要分析單個細(xì)胞中的體細(xì)胞DNA突變或從胚胎細(xì)胞分化至8個細(xì)胞時取出一個單細(xì)胞,對里面的全基因組進(jìn)行擴(kuò)增以便進(jìn)行胚胎植入前的遺傳病診斷或篩查。顯而易見的是,單細(xì)胞中的DNA(大約只有6 pg DNA)無法滿足測序的mg級樣品量需求。為了從少量樣品中獲得更多信息,全基因組擴(kuò)增技術(shù)(WGA)應(yīng)運(yùn)而生。
目前的WGA策略主要有三種:簡并寡核苷酸引物PCR擴(kuò)增(DOP-PCR)、多重置換擴(kuò)增(MDA),以及置換預(yù)擴(kuò)增和PCR擴(kuò)增的組合(MALBAC)。這三種WGA策略采用不同的實(shí)驗(yàn)操作和不同的酶,表現(xiàn)出不同的性能和偏向,適合不同的應(yīng)用。本產(chǎn)品有如下優(yōu)點(diǎn):
1.可以擴(kuò)增單個細(xì)胞的基因組達(dá)上萬倍。
2.具有全基因組擴(kuò)增的所有特點(diǎn),包括高產(chǎn)量和高保真性。
3.可使用各種來源的樣品,包括全血、干血、發(fā)根、口腔粘膜刮液、培養(yǎng)細(xì)胞、真菌、病毒等。
4.產(chǎn)物可用于多種后續(xù)試驗(yàn),包括多重PCR、長片端PCR、定量PCR、克隆、文庫構(gòu)建、單倍型分析、測序、基因芯片分析、各種遺傳分析(片段差異,微衛(wèi)星差異、SNP、STR)等。
應(yīng)用[4][5]
用于單細(xì)胞全基因組技術(shù)的建立和評價
單細(xì)胞是多細(xì)胞生物的基本單元,多細(xì)胞生物的發(fā)育從單細(xì)胞開始,在嚴(yán)格的時間和空間序列中不斷分裂,但是這樣的復(fù)雜過程只能在單細(xì)胞水平才能真正理解。另外,多細(xì)胞生物體內(nèi)每個細(xì)胞都處于獨(dú)特的微環(huán)境中,沒有兩個完全一樣的細(xì)胞,特別是腫瘤組織中,高度異質(zhì)性的存在使得從單細(xì)胞的角度進(jìn)行研究成為必須。結(jié)合單細(xì)胞分選技術(shù),通過全基因組擴(kuò)增技術(shù)和高通量分析技術(shù),單細(xì)胞的全基因組分析已經(jīng)成為可能,并已有一些應(yīng)用的實(shí)例。目前,單細(xì)胞分選技術(shù)大多局限于對懸浮細(xì)胞的分選。應(yīng)用于實(shí)體瘤研究領(lǐng)域則需要將實(shí)體瘤組織消化成細(xì)胞懸液,這樣一來,分選的細(xì)胞就丟失了所在的空間信息,因此,該法對于特定空間位置的細(xì)胞分選就無能為力了。
本文所建立的方法不僅對能對單個懸浮細(xì)胞進(jìn)行分選,更重要的是建立了一種組織切片中完整單個細(xì)胞核的激光顯微切割分選方法。該方法的建立為空間位置特異的細(xì)胞分選,例如轉(zhuǎn)移的少量癌細(xì)胞的分選提供了方法,并將大大減低測序的費(fèi)用。單細(xì)胞的基因組信息非常少,人的單個細(xì)胞基因組DNA量只有6pg,對這么微量的基因組DNA進(jìn)行測序,首先必須進(jìn)行全基因組放大。采用了GenomePlex Library的單細(xì)胞全基因組放大方法,并對該法的擴(kuò)增效率、重復(fù)性、保真性與擴(kuò)增線性進(jìn)行了研究,研究結(jié)果說明所得到的全基因組放大產(chǎn)物適用于下游的高通量研究。
參考文獻(xiàn)
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