背景[1-3]
SEQPLEX DNA擴(kuò)增試劑盒用于全基因組擴(kuò)增（WGA）的SeqPlex增強(qiáng)型DNA擴(kuò)增試劑盒,專門針對(duì)極小量或降解/高度片段化的DNA進(jìn)行二代測(cè)序（NGS）。染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）或福爾馬林固定的石蠟包埋組織樣品（FFPE）的DNA含量,通常不能滿足成功制備二代測(cè)序文庫的需求。
第二代測(cè)序（Next-generation sequencing，NGS）又稱為高通量測(cè)序（High-throughput sequencing），是基于PCR和基因芯片發(fā)展而來的DNA測(cè)序技術(shù)。我們都知道一代測(cè)序?yàn)楹铣山K止測(cè)序，而二代測(cè)序開創(chuàng)性的引入了可逆終止末端，從而實(shí)現(xiàn)邊合成邊測(cè)序（Sequencing by Synthesis）。二代測(cè)序在DNA復(fù)制過程中通過捕捉新添加的堿基所攜帶的特殊標(biāo)記（一般為熒光分子標(biāo)記）來確定DNA的序列，現(xiàn)有的技術(shù)平臺(tái)主要包括Roche的454 FLX、Illumina的Miseq/Hiseq等。由于在二代測(cè)序中，單個(gè)DNA分子必須擴(kuò)增成由相同DNA組成的基因簇，然后進(jìn)行同步復(fù)制，來增強(qiáng)熒光信號(hào)強(qiáng)度從而讀出DNA序列；而隨著讀長增長，基因簇復(fù)制的協(xié)同性降低，導(dǎo)致堿基測(cè)序質(zhì)量下降，這嚴(yán)格限制了二代測(cè)序的讀長（不超過500bp），因此，二代測(cè)序具有通量高、讀長短的特點(diǎn)。
二代測(cè)序適合擴(kuò)增子測(cè)序（例如16S、18S、ITS的可變區(qū)），而基因組、宏基因組DNA則需要使用鳥槍法（Shotgun method）打斷成小片段，測(cè)序完畢后再使用生物信息學(xué)方法進(jìn)行拼接。SeqPlex試劑盒可對(duì)這類DNA以及其他用于NGS的小量/高度片段化DNA樣品進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增。該試劑盒是WGA產(chǎn)品線的延伸產(chǎn)品,已被整合到Illumina、SOLiD TM 454測(cè)序工作流程中。SEQPLEX DNA擴(kuò)增試劑盒采用隨機(jī)引物技術(shù)擴(kuò)增片段化DNA,如ChIP或FFPE有助于對(duì)低至100 pg的ChIP DNA進(jìn)行測(cè)序采用增強(qiáng)型引物,可獲得完整的基因組覆蓋、最低的序列偏差、引物清除以及適用于二代測(cè)序的擴(kuò)增子大小可兼容用于二代測(cè)序的Illumina、SOLiD TM或454文庫制備。
應(yīng)用[4][5]
用于高通量測(cè)序技術(shù)在非小細(xì)胞肺癌基因檢測(cè)中的應(yīng)用研究
肺癌發(fā)病率最為常見的是非小細(xì)胞肺腺癌,部分基因的突變會(huì)導(dǎo)致肺癌的產(chǎn)生,如在部分患者中能檢測(cè)到EGFR、BRAF、KARS等等基因發(fā)生突變。在現(xiàn)階段臨床可通過定量即時(shí)聚合酶鏈鎖反應(yīng)（Quantitative real time polymerase chain reaction,Q-PCR）、非放射性原位雜交技術(shù)（fluorescence in situ hybridization,Fish）、多重引物PCR（multiplex PCR）等方式對(duì)患者進(jìn)行相關(guān)位點(diǎn)的基因突變檢測(cè),這些技術(shù)存在一次只能檢測(cè)一個(gè)基因或檢測(cè)成本高等問題。二代高通量測(cè)序方法（Next Generation Sequence,NGS）,可有效的實(shí)現(xiàn)不同基因和不同藥物作用位點(diǎn)的一次性檢出。設(shè)計(jì)了一個(gè)含284個(gè)肺癌相關(guān)基因的探針,用于臨床肺癌樣本基因組DNA經(jīng)過酶切打斷后獲得DNA文庫的雜交捕獲測(cè)序,進(jìn)行非小細(xì)胞肺癌基因突變的臨床檢測(cè)。
在本研究存在4個(gè)優(yōu)點(diǎn):1)建庫起始量降低至100ng;2)使用酶切建庫發(fā)替代物理超聲波打斷法;3)能同時(shí)對(duì)單核苷酸位點(diǎn)變異（single nucleotide variants,SNV）、插入缺失標(biāo)記（insertion-deletion,Indel）、融合基因（Fusion Gene）等不同突變類型進(jìn)行檢測(cè);4)建庫時(shí)間由3天縮短至1.5天;5)同時(shí)對(duì)比了BGISEQ-500測(cè)序儀與HISEQ-4000的數(shù)據(jù),結(jié)果顯示兩者間的一致性極高,基于成本的考慮,我們選擇了BGISEQ-500測(cè)序平臺(tái)。
本研究對(duì)已有的85例樣本,進(jìn)行了EGFR基因L858R、T790M突變、E746-A750缺失、KRAS基因G12D突變和EML4-ALK融合基因的突變檢測(cè),并比較在雙脫氧鏈終止法（sanger法）測(cè)序平臺(tái)、突變擴(kuò)增系統(tǒng)（amplification refractory mutation system,ARMS）平臺(tái)、免疫組織化學(xué)技術(shù)（immunocytochemistry,IHC）平臺(tái)的一致性驗(yàn)證,其符合度分別為94.1%、96.5%、95.3%、98.8%、100%,結(jié)果顯示NGS檢出結(jié)果與各平臺(tái)結(jié)果均有良好的一致性。使用自配標(biāo)準(zhǔn)品（EGFRL858R、EGFR19exondel、KRASG12D、ALKFusion）進(jìn)行10%、5%、3%、2%、1%、0.5%等頻率的檢測(cè),個(gè)別基因最低可檢出0.5%。
參考文獻(xiàn)
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[3]Translating genomic information into clinical medicine:lung cancer as a paradigm.Levy Mia A,Lovly Christine M,Pao William.Genome Research.2012
[4]Genome coverage and sequence fidelity of phi29 polymerase-based multiple strand displacement whole genome amplification.Paez J Guillermo,Lin Ming,Beroukhim Rameen,Lee Jeffrey C,Zhao Xiaojun,Richter Daniel J,Gabriel Stacey,Herman Paula,Sasaki Hidefumi,Altshuler David,Li Cheng,Meyerson Matthew,Sellers William R.Nucleic Acids Research.2004
[5]林木飛.高通量測(cè)序技術(shù)在非小細(xì)胞肺癌基因檢測(cè)中的應(yīng)用研究[D].華南理工大學(xué),2018.