背景[1-6]
IPSCS標(biāo)志物檢測是通過對IPSCS標(biāo)志物的進(jìn)行生物檢測以鑒定IPSCS的分化程度及功能的一種手段。誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells，iPS cells）是把Oct3/4,Sox2、c-Myc和Klf4這四種轉(zhuǎn)錄因子基因克隆入病毒載體，然后引入小鼠成纖維細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)可誘導(dǎo)其發(fā)生轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生的iPS細(xì)胞在形態(tài)、基因和蛋白表達(dá)、表觀遺傳修飾狀態(tài)、細(xì)胞倍增能力、類胚體和畸形瘤生成能力、分化能力等方面都與胚胎干細(xì)胞相似。誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(Induced pluripotent stem cells,PSCs)技術(shù)是指通過導(dǎo)入特定的轉(zhuǎn)錄因子將終末分化的體細(xì)胞重編程為多能性干細(xì)胞。分化的細(xì)胞在特定條件下被逆轉(zhuǎn)后,恢復(fù)到全能性狀態(tài),或者形成胚胎干細(xì)胞系,或者進(jìn)一步發(fā)育成新個(gè)體的過程即為細(xì)胞重編程(Cell reprogramming)。
分化是基因選擇性表達(dá)的結(jié)果,并沒有改變遺傳物質(zhì),而重編程在某種意義上就是分化的一個(gè)逆轉(zhuǎn)。與經(jīng)典的胚胎干細(xì)胞技術(shù)和體細(xì)胞核移植技術(shù)不同,PSCs技術(shù)不使用胚胎細(xì)胞或卵細(xì)胞,因此沒有倫理學(xué)問題。此外,利用IPSCS技術(shù)可以用病人自己的體細(xì)胞制備專有的干細(xì)胞,從而大大降低了免疫排斥反應(yīng)發(fā)生的可能性。iPSCS的岀現(xiàn),在干細(xì)胞、表觀遺傳學(xué)以及生物醫(yī)學(xué)等研究領(lǐng)域都引起了強(qiáng)烈的反響,使人們對多能性的調(diào)控機(jī)制有了突破性的新認(rèn)識(shí),進(jìn)一步拉近了干細(xì)胞和臨床疾病治療的距離。
iPSCS在細(xì)胞替代性治療以及發(fā)病機(jī)理的研究、新藥篩選以及神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心血管疾病等臨床疾病治療等方面具有巨大的潛在價(jià)值。IPSCS標(biāo)志物是在IPSCS分化完成后才能生產(chǎn)的特異性物質(zhì)包含RNA、蛋白及其他物質(zhì)。通過檢測這些特異性物質(zhì)就可以了解到細(xì)胞的分化程度這對后續(xù)的實(shí)驗(yàn)有著指導(dǎo)性的作用。
應(yīng)用[7][8]
用于白內(nèi)障患者誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（iPS）的建立及其定向分化的研究
白內(nèi)障摘除聯(lián)合人工晶狀體(intraocular lens,IOL)植入是目前治療白內(nèi)障最常用且效果較為理想的方法,而后囊膜混濁(posterior capsular opacification,PCO)是影響病人術(shù)后遠(yuǎn)期視力預(yù)后的最常見的并發(fā)癥,其術(shù)后5年的發(fā)生率高達(dá)30%左右。
體細(xì)胞誘導(dǎo)成為多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)的研究成果被國際生命科學(xué)界譽(yù)為具有里程碑意義的創(chuàng)新之舉。方法正常人晶體上皮細(xì)胞培養(yǎng)取材于角膜移植術(shù)后供體眼的晶狀體囊膜,年齡相關(guān)性白內(nèi)障晶體上皮細(xì)胞培養(yǎng)取材于白內(nèi)障超乳手術(shù)中撕除的晶體前囊膜。取年齡相關(guān)性白內(nèi)障患者的皮膚組織,剪成1mm3大小的組織塊,過夜消化,離心收集細(xì)胞,經(jīng)多次傳代后,獲得較為純化的皮膚成纖維細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。在倒置相差顯微鏡下對三種細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。采用CCK-8法連續(xù)7天測定三種細(xì)胞的增殖速率,繪制生長曲線并進(jìn)行比較。結(jié)果正常人晶體囊膜組織塊貼壁48～72小時(shí)后可見人晶狀體上皮細(xì)胞從組織塊邊緣長出,約10～15天達(dá)到融合。初期正常人晶體上皮細(xì)胞為多角形,胞體透亮,細(xì)胞邊界清晰。融合后的細(xì)胞具有上皮細(xì)胞的形態(tài)特征,為典型的六角形或多邊形。
分別構(gòu)建表達(dá)OCT-4、SOX-2和KLF-4的慢病毒載體(Lentivirus),并轉(zhuǎn)染年齡相關(guān)性白內(nèi)障患者體外培養(yǎng)的晶體上皮細(xì)胞,誘導(dǎo)建立患者來源的誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞,與同一患者來源的皮膚成纖維細(xì)胞對比,觀察限定因子對于誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的誘導(dǎo)效率。分別將含有OCT-4、SOX-2和KLF-4的慢病毒載體質(zhì)粒(plenti-hOCT4/plenti-hSOX2/plenti-hKLF4)同輔助質(zhì)粒(pCMV-gag-pol-PA/pCMV-VSVg)一起共感染293T細(xì)胞,重組包裝構(gòu)建慢病毒載體(分別為Lenti-OCT-4/Lenti-SOX-2/Lenti-KLF-4).將構(gòu)建的三種慢病毒載體混合分別感染第2代的白內(nèi)障晶體上皮細(xì)胞和人皮膚成纖維細(xì)胞,培養(yǎng)5天后,與小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(mouse embryonic fibroblasts,MEFs)進(jìn)行共培養(yǎng),直至出現(xiàn)iPSCs。
對誘導(dǎo)建立的白內(nèi)障患者來源的誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(iPSCs)進(jìn)行鑒定,檢測細(xì)胞的分子標(biāo)記及體內(nèi)外分化能力,評價(jià)其多能性。方法對已成功誘導(dǎo)的白內(nèi)障患者來源的iPSCs進(jìn)行多能性鑒定：基因表達(dá)、免疫熒光染色分析、RT-PCR檢測、體外分化擬胚體、體內(nèi)分化畸胎瘤檢測。提取iPSCs、ESCs和白內(nèi)障患者晶體上皮細(xì)胞的總RNA采用HG-U133-2array(Affymetrix)對三種細(xì)胞的全基因表達(dá)譜進(jìn)行檢測并進(jìn)行對比。
參考文獻(xiàn)
[1]Differential effects of planktonic and biofilm MRSA on human fibroblasts[J].Garth A.James,John E.Olerud.Wound Repair Regen.2012(2)
[2]Prospect of Induced Pluripotent Stem Cell Genetic Repair to Cure Genetic Diseases[J].Jeanne Adiwinata Pawitan,Rajarshi Pal.Stem Cells International.2012
[3]Potential rescue,survival and differentiation of cancer stem cells and primary non-transformed stem cells by monocyte-induced split anergy in natural killer cells[J].Anahid Jewett,Han-Ching Tseng.Cancer Immunology,Immunotherapy.2012(2)
[4]Noggin[J].Carola Krause,Asja Guzman,Petra Knaus.International Journal of Biochemistry and Cell Biology.2011(4)
[5]Reconstitution of the Mouse Germ Cell Specification Pathway in Culture by Pluripotent Stem Cells[J].Katsuhiko Hayashi,Hiroshi Ohta,Kazuki Kurimoto,Shinya Aramaki,Mitinori Saitou.Cell.2011(4)
[6]The lens:a classical model of embryonic induction providing new insights into cell determination in early development[J].Lena Gunhaga.Philosophical Transactions of the Royal Society B.2011(1568)
[7]Bone morphogenetic protein 7(BMP7)mutations are associated with variable ocular,brain,ear,palate,and skeletal anomalies[J].Alexander W.Wyatt,Robert J.Osborne,HelenStewart,Nicola K.Ragge.Hum.Mutat..2010(7)
[8]邱曉頔.白內(nèi)障患者誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（iPS）的建立及其定向分化的研究[D].復(fù)旦大學(xué),2012.