AFLP試劑盒（EcoRI-MseI）

產(chǎn)品及特點AFLP（amplified fragment length polymorphism）原理是一種結(jié)合 RFLP 和 PCR 技術(shù)特點的、迄今為止最有效分子標記分型技術(shù)，其原理如下：本產(chǎn)品在傳統(tǒng) AFLP-PCR 的基礎(chǔ)上經(jīng)過精心優(yōu)化而開發(fā)，它具有下列特點：

1. 一站式，足夠 50 次酶切-連接反應(yīng)、40 次預(yù)擴反應(yīng)和 1500 次 AFLP PCR（30 uL體系計算），但不包括 DNA 純化和帶型分析試劑（如 PAGE 電泳試劑和銀染試劑）。

2. 本系列產(chǎn)品提供 EcoRI-MseI 組合，適用于 GC 含量在 50%以上的基因組。對GC 含量在 50%以下的基因組，需從本公司采購 AFLP 的 EcoRI-TaqI 組合。

3. 各種參數(shù)都經(jīng)過優(yōu)化，一次 PCR 所得 AFLP 片段數(shù)一般在 10-100 之間，可重復(fù)性好，誤差小于 0.6%。

4. 本產(chǎn)品適用于基因組在 500 Mb-6000 Mb 的材料（如動物和植物）。對于基因組在 50-500 Mb 的材料（如細菌和真菌）或 50Mb 以下的材料（如質(zhì)粒，cosmid，BAC，YAC 和 PAC 等），需要分別另購+0 型預(yù)擴增引物對+2 型擴增引物。

規(guī)格及成分 成 份 編 號 小扁盒包裝
AFLP 酶切-連接 Buffer，10× LM100903a 100 uL（綠蓋）
AFLP EcoRI-MseI 酶混合液 100903b 50 uL（紅蓋）
AFLP EcoRI-MseI 接頭混合物 100903c 1000 uL（黃蓋）
T4 DNA 連接酶 120411 50 uL（藍蓋）
PCR MagicMix 3.0 90805 5 mL×6（塑料袋）
+1 型 EcoRI-MseI 預(yù)擴增引物對 100903d 500 uL（白蓋）
+3 型 EcoRI 引物（8 條） 100903e 十孔盒 1
+3 型 MseI 引物（8 條） 100903f 十孔盒 2
使用手冊 100903sc 1 份

運輸及保存 低溫運輸、-20℃保存, 有效期一年。

自備試劑 超純水、Southern 級 DNA 純化試劑，尿素-PAGE 電泳套裝，銀染試劑盒。

使用方法 

一、 DNA 提取（本試劑盒不提供相關(guān)試劑）用戶需要自備 50-500ng Southern 級別的基因組 DNA，DNA 酶切徹底是 AFLP 的關(guān)鍵，所以好預(yù)實驗以確保 DNA 能夠被 EcoRI 和 MseI 內(nèi)切酶徹底切開。

二、 限制性酶切和接頭連接反應(yīng)（本試劑盒足夠 50 次 20uL 體系的酶切-連接反應(yīng)）

1. 在 0.2 mL 離心管中設(shè)置 20 uL 的限制性內(nèi)切酶酶切體系：

成分 用量

AFLP 酶切-連接 Buffer，10× 2 uL

樣品 DNA

50 ng（對小基因組材料）

500 ng（對大基因組材料）

AFLP EcoR I-Mse I 酶混合液 1 uL

自備超純水 加水到 20 uL

2. 輕柔混勻并短暫離心后，37℃保溫 2 小時酶切（若 PCR 儀器不帶熱蓋，則必須加 50uL自備石蠟油，否則水分會蒸發(fā)影響反應(yīng)。下同）。反應(yīng)結(jié)束后 70℃保溫 15 分鐘滅活酶。

3. 在體系中加入 20 uL EcoRI-MseI 接頭混合物和 1 uL T4 DNA 連接酶，輕柔混勻并短暫離心，20℃保溫 2-3 小時讓接頭跟酶切 DNA 片段相連。

4. 反應(yīng)結(jié)束后在 40uL 的連接反應(yīng)體系中加入自備 360uL超純水，得到連接液10 倍稀釋液，直接作為模板用于下步的預(yù)擴增或放-20℃保存待用。

三、 預(yù)擴增（本試劑盒足夠 40 次 30uL 體系的預(yù)擴增反應(yīng)）

5. 在 0.2 mL 離心管中設(shè)置 30 uL 的預(yù)擴 PCR 體系：成分 體積

連接液 10 倍稀釋液（來于第 4 步） 5 uL

+1 型 EcoRI-MseI 預(yù)擴增引物對 10 uL

PCR MagicMix 3.0 15 uL

20180925dx

6. 離心數(shù)秒，按下列參數(shù)進行 PCR 預(yù)擴增（注意：一步是預(yù)合成，跟常規(guī) PCR 不同）：預(yù)合成 72℃ 2 分鐘，PCR 循環(huán) 20 次（94℃30S，56℃60S，72℃60S）

7. 取 10 uL PCR 產(chǎn)物在 1.5%瓊脂糖膠上電泳檢測，產(chǎn)物應(yīng)為大小在 100-1500 bp 的模糊條帶。本試劑盒的 PCR mix 含上樣液和示蹤染料，故不需要額外加 Loading Buffer。示蹤染料的泳動速度相當于 50bp 的 DNA 片段。

8. 在剩下的 20uL 預(yù)擴增反應(yīng)液中加入 980uL 自備超純水，相當于稀釋 50 倍，所得 50 倍PCR 稀釋液，直接作為模板用于下步擴增或放-20℃保存待用。

四、選擇性 PCR 擴增9. 制備引物：在十孔盒 1 和十孔盒 2 的共 16 管引物干粉中分別加入 1100uL 自備超純水，震蕩混勻得 16 管引物母液。每管取 66uL 引物母液與 1034uL 超純水在 1.5mL 離心管中混合得 1100uL 此引物的工作液，共 16 管引物工作液。

10. 在 0.2 mL PCR 管中，加入下列成分（一次 PCR 時需要測試所有 8×8=64 種引物組合，需設(shè)置 64 個 PCR 反應(yīng)。若已經(jīng)知道哪個一種或幾種引物組合適合，則可以直接使用

選中的引物），下面以一種 3 型 EcoR I 引物和+3 型 Mse I 引物組合為例：

成分 體積

50 倍 PCR 稀釋液 5 uL

AFLP+3 型 EcoR I 引物工作液（八種之一） 5 uL

AFLP+3 型 Mse I 引物工作液（八種之一） 5 uL

PCR MagicMix 3.0 15 uL

11. 輕柔混勻后離心數(shù)秒，按下列參數(shù)進行 PCR：

溫度 時間

PCR（13 次）

94℃ 30 秒

65℃ 30 秒（每次循環(huán)遞減 0.7℃）

72℃ 60 秒

PCR（23 次）

94℃ 30 秒

55℃ 30 秒

72℃ 60 秒

延伸 72℃ 5 分鐘

四、 尿素-PAGE 電泳和銀染（需另購試劑并按相關(guān)手冊進行）

12. PCR 結(jié)束后進行尿素-PAGE 電泳和銀染分析。