植物葉綠體純化試劑盒

產(chǎn)品及特點(diǎn)葉綠體是重要的，負(fù)責(zé)植物光合作用的細(xì)胞器，很多重要的特性(如雄性不育) 也跟葉綠體相關(guān)，所以葉綠體是研究植物生理和母系遺傳的重要材料。對(duì)植物葉綠 體進(jìn)行生化，遺傳和分子生物學(xué)研究都需要進(jìn)行葉綠體純化。本產(chǎn)品就是基于密度 梯度離心的，專門用于從植物葉片中純化完整葉綠體的試劑盒。它具有下列特點(diǎn)：

1. 即用型試劑盒，用戶不需要單獨(dú)配制各種溶液。

2. 提供 AB 兩種選擇，A 型用于葉綠體粗提，所得葉綠體含少量其他細(xì)胞器污染， 可用于后續(xù)的 SDS-PAGE，Western，ELSIA 和蛋白組分析。B 型用于葉綠 體精提，所得葉綠體完整，可用于后續(xù)的光合作用，電子鏈和磷酸化，跨膜轉(zhuǎn) 運(yùn)，體外葉綠體蛋白合成，蛋白定位等研究。還可用于的葉綠體膜，基質(zhì)，類 囊體，葉綠體 DNA 和葉綠體 RNA 純化。

3. 本產(chǎn)品足夠 15 次提取，每次可處理 30g 葉片，能得到 5 mg 左右葉綠體。

4. 已經(jīng)成功用于菠菜，大豆，萵筍，白菜，煙草和甜菜等植物，還可用于更多植 物（可能需要優(yōu)化條件）。 
規(guī)格及成分 成 份 編 號(hào) 大紙盒包裝
溶液 A 成分一 LM120308A1 250 mL×2
溶液 A 成分二（干粉） LM120308A2 3 g
溶液 B LM120308B 60 mL
帶柄尼龍濾膜 LM120308C 1 個(gè)
使用手冊(cè) LM120308sc 1 份

運(yùn)輸及保存 常溫運(yùn)輸和保存，試劑盒期限一年。

自備試劑 去離子水。

使用方法 注意：葉綠體對(duì)溫度高度敏感，所以整個(gè)操作必須在冰上或者在冷室進(jìn)行，所用器皿和溶液均需要在 4℃預(yù)冷。離心時(shí)一定要在 4℃進(jìn)行，離心力以 g 而不是 rpm計(jì)算。如果需要研究葉綠體的功能，提取過程還需要在昏暗的光線條件下進(jìn)行。

1. 實(shí)驗(yàn)前 1-2 天將植物放在暗室培養(yǎng)以減少葉綠體中淀粉顆粒的形成，否則離心時(shí)這些顆粒很容易使葉綠體破裂。葉片在實(shí)驗(yàn)前需先用自來水洗凈，再用蒸餾水淋洗，去掉多余水分。如果葉片采集后不能立即處理，則保存時(shí)需要保持葉片濕潤，即使如此，葉片的放置時(shí)間也不能超過一天。

2. 新鮮（實(shí)驗(yàn)當(dāng)天）制備溶液 A：將自備的去離子水與溶液 A 成分一按 4：1 的比例混合，然后在混合液中加入溶液 A 成分二干粉到終濃度 0.1%（每 100 mL中加入 0.1 g 干粉），搖晃溶解后所得溶液即為溶液 A，冰上預(yù)冷待用。一次實(shí)驗(yàn)（從 30 g 葉片提取葉綠體）所需要的溶液 A 體積跟材料不同而不同。溶液 A 不能長期保存，需要現(xiàn)用現(xiàn)配。

3. 新鮮采集植物葉片，快速去除葉脈并將葉片剪成 1-3 cm2大小的碎片并浸泡在適量的預(yù)冷的溶液 A 中（每克葉片加 4 mL 溶液 A，但對(duì)煙草和大豆，每克葉片需要加 6 mL 溶液 A）。

4. 將浸泡了葉片的溶液 A 轉(zhuǎn)移到 Waring 勻漿機(jī)（即家用制備果汁的勻漿機(jī)）中，低速勻漿 10 秒，避免起泡沫。用玻璃棒把液面的碎片按入勻漿機(jī)底部后，再低速勻漿 10 秒。注意：除 Waring 勻漿機(jī)外，還可以選擇 Dounce 玻璃勻漿器，Polytron 勻漿機(jī)和研磨（加玻璃珠）等裂解細(xì)胞的方法，但這些方法的單次處理量都比較小，需要將樣品分成很多小份單獨(dú)勻漿，然后再匯集。

5. 用帶柄尼龍濾膜過濾勻漿液，可先將濾液收集到預(yù)冷的 200 mL 量筒中，再等分到 4 個(gè)預(yù)冷的 50 mL 的塑料離心管中（每個(gè)管中的濾液不要超過 35mL）。帶柄尼龍濾膜后可反復(fù)使用。

6. 在水平轉(zhuǎn)子離心機(jī)上 4℃ 200 g 離心 3 分鐘（對(duì)菠菜，白菜和萵筍材料）或400 g 離心 1 分鐘（對(duì)甜菜材料），白色沉淀為未破裂的細(xì)胞或細(xì)胞核。

7. 將上清液（含葉綠體）轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的、預(yù)冷的 50 mL 塑料離心管中。

8. 在水平轉(zhuǎn)子離心機(jī)上 4℃ 1000 g 離心 7 分鐘，小心棄上清，沉淀含葉綠體，呈淺綠色。

9. 在沉淀中加入 1.5 mL 預(yù)冷的溶液 A，手彈離心管底部使葉綠體重懸。注意：重懸時(shí)好避免溶液起泡，也不要用槍頭吹打，否則葉綠體容易破裂。沉淀下有白色淀粉屬于正?，F(xiàn)象，但重懸葉綠體時(shí)避免將白色淀粉重懸。

10. 將 4 管葉綠體重懸液匯集（共約 6 mL）。此溶液為葉綠體粗提產(chǎn)物，可直接用于后續(xù)的 SDS-PAGE，Western，ELSIA 和蛋白組分析。如果需要以之為材料精提葉綠體，就需要將破裂的葉綠體和完整的葉綠體分開，根據(jù)植物的不同，可選用下述兩種密度梯度離心法之一進(jìn)行分離。

11. 單濃度分離法（適合菠菜，白菜和萵筍等材料）：

a) 在 50 mL 塑料離心管中先加入 6 mL 溶液 A 成分一和 4 mL 溶液 B，充分混合均勻。

b) 在其液面上小心鋪上第 11 步匯集得到的約 6 mL 葉綠體重懸液。

c) 在水平轉(zhuǎn)子離心機(jī)上 4℃ 1000 g 離心 8 分鐘，最上層的綠色帶含破碎的葉綠體，線粒體和核糖體等，管底的綠色沉淀為完整的葉綠體。

d) 小心將上清倒出后，在葉綠體沉淀中加入預(yù)冷的 0.5 mL 溶液 A 成分一，手指輕彈管底使之重懸。

e) 將葉綠體重懸液轉(zhuǎn)移到 1.5mL 離心管中并避光保存?？稍谙嗖铒@微鏡下檢查葉綠體完整性。葉綠體必須盡快使用，否則非常容易失去活性。

12. 雙濃度分離法（適合煙草，甜菜和大豆等材料）：

a) 在 14 mL 塑料離心管中先加入 0.5 mL 溶液 A 和 2 mL 溶液 B，充分混合均勻，得密度梯度重液。

b) 在另一試管中將 3 mL 溶液 A 和 2 mL 溶液 B 充分混合均勻，得密度梯度輕液。

c) 將密度梯度輕液小心鋪在密度梯度重液之上，然后將第 10 步匯集得到的葉綠體重懸液中的 4 mL(還剩下 2 mL)小心鋪在密度梯度輕液之上。

d) 在水平轉(zhuǎn)子離心機(jī)上 4℃ 3200 g 離心 15 分鐘，最上層綠色帶含破碎的葉綠體、線粒體和核糖體等，重液和輕液間的綠色帶為完整葉綠體。

e) 用廣口吸管小心將重液和輕液之間的綠色帶（葉綠體）轉(zhuǎn)移到新的離心管

中，加入三倍體積的預(yù)冷的溶液 A 成分一，輕柔混勻。

f) 在水平轉(zhuǎn)子離心機(jī)上 4℃ 1700 g 離心 1 分鐘，小心將上清倒出后，在綠色的葉綠體沉淀中加入預(yù)冷的 0.5 mL 溶液 A 成分一，手指輕彈管底使之葉綠體重懸。

g) 將葉綠體重懸液轉(zhuǎn)移到 1.5 mL 離心管中并避光保存，也可在相差顯微鏡下檢查葉綠體完整性。葉綠體必須盡快使用，否則非常容易失去活性。所得精提葉綠體可用于后續(xù)的光合作用，電子鏈和磷酸化，跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，體外葉綠體蛋白合成，蛋白定位等研究。還可用于的葉綠體膜，基質(zhì)，類囊體，葉綠體 DNA 和葉綠體 RNA 純化。