植物葉綠體總蛋白提取試劑盒

產(chǎn)品及特點 本試劑盒是結(jié)合植物葉綠體純化試劑盒和細菌蛋白質(zhì)提取試劑盒而推出的 新興產(chǎn)品，專門用于植物葉綠體蛋白的快速提取。它具有下列特點：

1. 即用型試劑盒，用戶不需要單獨配制各種溶液。

2. 本產(chǎn)品足夠 15 次提取，每次可處理 30g 葉片。

3. 得到的提取物可以直接用于 SDS-PAGE、2D 電泳、免疫印跡分析、蛋白 活性測定和 BCA 法及 Lowry 法蛋白定量（不適用于 Bradford 法）。

4. 已經(jīng)成功用于菠菜、大豆、萵筍、白菜、煙草和甜菜等植物，還可用于更 多植物（可能需要優(yōu)化條件）。 
規(guī)格及成分 成 份 編 號 大紙盒包裝
植物葉綠體純化勻漿液成分一 120308a1 250 mL×2
植物葉綠體純化勻漿液成分二
（干粉） 120308a2 3 g
Percoll 131134 60 mL
帶柄尼龍濾膜 120308b 1 個
植物葉綠體蛋白提取溶液 A 130887a 15 mL
植物葉綠體蛋白提取溶液 B 130887b 1.5 mL
使用手冊 130887sc 1 份

運輸及保存 常溫運輸和保存, 但植物葉綠體蛋白提取溶液 A 和植物葉綠體蛋白提取溶液 B 需要-20℃保存。保存期限一年。

自備試劑 去離子水

使用方法

注意：葉綠體對溫度高度敏感，所以整個操作必須在冰上或者在冷室進行，所 用器皿和溶液均需要在 4℃預(yù)冷。離心時一定要在 4℃進行，離心力以 g 而不是 rpm 計算。如果需要研究葉綠體的功能，提取還需要在昏暗的光線條件下進行。

一：葉綠體的純化

1. 實驗前 1-2 天將植物放在暗室培養(yǎng)以減少葉綠體中淀粉顆粒的形成，否則 離心時這些顆粒很容易使葉綠體破裂。葉片在實驗前需先用自來水洗凈， 再用蒸餾水淋洗，去掉多余水分。如果葉片采集后不能立即處理，則保存 時需要保持葉片濕潤，即使如此，葉片的放置時間也不能超過一天。

2. 新鮮（實驗當(dāng)天）制備勻漿液：將自備的去離子水與勻漿液成分一按 4：1 的比例混合，然后在混合液中加入勻漿液成分二干粉到終濃度 0.1%（每 100 mL 中加入 0.1 g 干粉），搖晃溶解后所得溶液即為勻漿液，冰上預(yù)冷 待用。一次實驗（從 30 g 葉片提取葉綠體）所需要的勻漿液體積跟材料不 同而不同。

3. 新鮮采集植物葉片，快速去除葉脈并將葉片剪成 1-3 cm2大小的碎片并浸 泡在適量的預(yù)冷的勻漿液中（每克葉片加 4 mL 勻漿液，但對煙草和大豆， 每克葉片需要加 6 mL 勻漿液）。

4. 將浸泡了葉片的勻漿液轉(zhuǎn)移到 Waring 勻漿機（即家用制備果汁的勻漿機） 中，低速勻漿 10 秒，避免起泡沫。用玻璃棒把液面的碎片按入勻漿機底部 后，再低速勻漿 10 秒。注意：除 Waring 勻漿機外，還可以選擇 Dounce 玻璃勻漿器，Polytron 勻漿機和研磨（加玻璃珠）等裂解細胞的方法，但 這些方法的單次處理量都比較小，需分成很多小份單獨勻漿，然后再匯集。

5. 用帶柄尼龍濾膜過濾勻漿液，可先將濾液收集到預(yù)冷的 200 mL 量筒中， 再等分到 4 個預(yù)冷的 50 mL 的塑料離心管中（每個管中的濾液不要超過 35 mL）。帶柄尼龍濾膜后可反復(fù)使用。

6. 在水平轉(zhuǎn)子離心機上 4℃ 200 g 離心 3 分鐘（對菠菜，白菜和萵筍材料） 或 400 g 離心 1 分鐘（對甜菜材料），白色沉淀為未破裂的細胞或細胞核。

7. 將上清液（含葉綠體）轉(zhuǎn)移到一個新的、預(yù)冷的 50 mL 塑料離心管中。

8. 在水平轉(zhuǎn)子離心機上 4℃ 1000 g 離心 7 分鐘，小心棄上清，沉淀含葉綠 體，呈淺綠色。

9. 在沉淀中加入 1.5 mL 預(yù)冷的勻漿液，手彈離心管底部使葉綠體重懸。注 意：重懸時好避免溶液起泡，也不要用槍頭吹打，否則葉綠體容易破裂。 沉淀下有白色淀粉屬于正常現(xiàn)象，但重懸葉綠體時避免將白色淀粉重懸。

10. 將 4 管葉綠體重懸液匯集（共約 6 mL），得到葉綠體粗提液，可直接用于 后續(xù)的 SDS-PAGE，Western，ELISA 和蛋白組分析。

11. 如果需要以之為材料精提葉綠體，就需要用密度梯度離心法將完整的葉綠 體和其他污染物進一步分離。具體操作步驟是：在 50 mL 塑料離心管中先 加入 6 mL 勻漿液成分一和 4 mL Percoll，充分混合均勻。在其液面上小 心鋪上葉綠體粗提液。在水平轉(zhuǎn)子離心機上 4℃ 1000 g 離心 8 分鐘，管 底綠色沉淀為完整的葉綠體。小心將上清倒出后，用于葉綠體蛋白提取。 

二：葉綠體蛋白質(zhì)的提取

12. 將 1 mL 的溶液 A 和 100 uL 溶液 B 加入到葉綠體沉淀（約 15 mg 濕重） 中，吹打混勻。

13. 冰上放置 30 分鐘至 1 小時至溶液變清。

14. 4℃ 1,2000 g 離心 1 分鐘。

15. 將上清液轉(zhuǎn)移至一新的 1.5 mL 塑料離心管中即得到蛋白溶液，可置于 -70℃冰箱保存或立即使用。如果要進行 SDS-PAGE 電泳，可取部分樣品 到離心管中，加入 5×SDS-PAGE 上樣緩沖液（終濃度為 1×），在沸水中 處理 5 分鐘后立即上樣電泳。