DNA Shuffling試劑盒

產(chǎn)品及特點(diǎn)DNA Shuffling 即 DNA 分子的體外同源重組，它是一種分子水平上的定向進(jìn)化(directed evolution)技術(shù)，它以一個(gè)或多個(gè)基因?yàn)槠鹗疾牧希ㄟ^(guò)先隨機(jī)斷裂成小片段，再進(jìn)行互為模板和引物的 PCR（無(wú)外加引物），后再進(jìn)行常規(guī)PCR（外加引物）等處理，后得到含有大量 DNA 重組突變的 PCR 產(chǎn)物。其原理示意圖如下：

本產(chǎn)品就是根據(jù)上述原理優(yōu)化改進(jìn)而成，它具有下列特點(diǎn)：

1. 即開(kāi)即用，用戶只需要提供樣品 DNA 模板，無(wú)需單獨(dú)準(zhǔn)備各成分。

2. 可以用于對(duì)長(zhǎng)度在 1000bp 的同源片段進(jìn)行 shuffling。

3. 操作手冊(cè)經(jīng)過(guò)優(yōu)化，1-2 天即可完成，節(jié)省大量?jī)?yōu)化時(shí)間。

4. 本產(chǎn)品足夠 10 次 DNA Shuffling 反應(yīng)，只適用于科研，不能用于臨床。
規(guī)格及成分 成分 編號(hào) 十孔盒包裝
PCR MagicMix LM90805 1 mL×3
DNase I 溶液（0.1U/μL） LM90903a 10 μL
DNA Shuffling 試劑盒溶液 A，10× LM131178a 100 μL
DNA Shuffling 試劑盒溶液 B，10× LM131178b 100 μL
超純水 LM100935 1 mL
使用手冊(cè) LM131178sc 1 份

運(yùn)輸及保存 低溫運(yùn)輸，-20℃保存，保存期限一年。

自備試劑 待突變基因片段、DNA Shuffling 引物（第二輪 PCR 引物）、膠回收試劑盒。

使用方法 

1. 提前開(kāi)啟 37℃和 75℃水浴或金屬浴。

2. 待突變基因片段的制備：待突變基因片段可以用多個(gè)含同源片段的質(zhì)粒為模板、用 PCR 法或酶切法制備。制備時(shí)需保證含起始同源片段（或此同源片段的一部分）的 DNA 片段總長(zhǎng)度要比 DNA shuffling 終產(chǎn)物（第二輪 PCR產(chǎn)物）長(zhǎng) 200-400 bp，即第二輪 PCR 的引物位置要在此步模板制備引物內(nèi)側(cè) 100-200bp，第二輪 PCR 產(chǎn)物的長(zhǎng)度在 1000bp 以下。每次 DNAShuffling 實(shí)驗(yàn)至少需要 2 μg 起始同源片段（如果含兩個(gè)以上同源片段，則彼此的比例為 1:1:1），最多可以使用 5 μg 起始同源片段，并且必須通過(guò)膠回收的方法回收，以便徹底去除殘留的質(zhì)粒模板、引物和非特異擴(kuò)增產(chǎn)物等（如果不去除此步的引物，其將對(duì)后續(xù) PCR 造成嚴(yán)重干擾）。后需用分光光度法準(zhǔn)確定量，此溶液即為同源片段，放冰上待用。

3. 準(zhǔn)備 DNase I 工作液，將 1 μL 本試劑盒提供的 DNase I 溶液、8uL 超純水、1 μL DNA Shuffling 試劑盒溶液 A 混合得 DNase 工作液，放冰上待用。DNase 工作液必須現(xiàn)配現(xiàn)用。

4. 設(shè)置同源片段碎片化反應(yīng)：在一個(gè) PCR 管中，按順序加入下列成分：

成分 用量

同源片段（來(lái)于兩個(gè)以上不同基因） 2-5 μg

DNA Shuffling 試劑盒溶液 A，10× 5 μL

DNA Shuffling 試劑盒溶液 B，10× 5 μL

DNase 工作液 2 μL

補(bǔ)超純水到 50 μL

5. 充分輕柔吹打混勻后 37℃水浴 8 分鐘，然后立即放 75℃水浴處理 10 分鐘以滅活 DNase I。

6. 在 2-3%瓊脂糖凝膠上電泳，用常規(guī)的膠回收法回收 25-150 bp 范圍的所有片段，分光光度法精確測(cè)定回收片段的濃度。此即為回收片段，放冰上待用。注意：一定要加合適的 DNA marker 以便確定片段范圍。

7. 回收片段重組反應(yīng)：在一干凈 PCR 管中加入 0.5 μg 回收片段、50 μL PCRMix 3.0、補(bǔ)加超純水到 100 μL。反應(yīng)總體積為 100 μL

8. 按下面的 PCR 反應(yīng)參數(shù)進(jìn)行一輪無(wú)引物 PCR：

過(guò)程 溫度 時(shí)間

PCR 前變性 94℃ 150 s

PCR 反應(yīng)

（40 循環(huán)）

94℃ 30 s

47.5℃ 45 s

72℃ 10 s，每次循環(huán)后增加 5s

PCR 后延伸 72℃ 10 min

9. 取 5-10 μL 進(jìn)行電泳檢測(cè)（本 PCR Mix 含上樣成分，可以直接上樣。紅色示蹤劑的泳動(dòng)速度相當(dāng)于 50bp DNA），然后對(duì)預(yù)期長(zhǎng)度區(qū)域的 PCR 產(chǎn)物進(jìn)行回收（如果 Shuffling 的同源區(qū)域長(zhǎng)度為 800bp，則回收 600-1000bp范圍的片段），得到一輪 PCR 回收產(chǎn)物。

10. 留部分一輪 PCR 回收產(chǎn)物之后，用超純水將其分別稀釋 10 倍、20 倍和50 倍，放冰上待用。

11. 取一輪 PCR 回收產(chǎn)物原液、10 倍稀釋液、20 倍稀釋液和 50 倍稀釋液各 1uL 作為 PCR 模板，按下表設(shè)置 4 管第二輪 PCR 反應(yīng)（100μL 體系）。

成分 1-4 號(hào)管

PCR 模板（4 種） 各 1 μL（1 號(hào)加原液、2 號(hào)加 10

倍稀釋液、以此類推）

PCR MagicMix 3.0 50 μL

自備 DNA Shuffling 引物 每管各加 30 pmol

超純水 加到 100 μL

12. 按下列 PCR 參數(shù)進(jìn)行 PCR：

過(guò)程 溫度 時(shí)間

活化 94℃ 150 s

PCR 反應(yīng)

（25 次循環(huán)）

94℃ 30 s

47.5℃ 45 s

72℃ 60 s，每次循環(huán)后增加 5s

PCR 后延伸 72℃ 10 min

13. 電泳檢測(cè) 4 個(gè) PCR 產(chǎn)物，回收預(yù)期大小的 PCR 產(chǎn)物（根據(jù)引物位置估計(jì)預(yù)期大?。?，用于后續(xù)克隆和分析實(shí)驗(yàn)（略）。