DNA Shuffling試劑盒

產(chǎn)品及特點DNA Shuffling 即 DNA 分子的體外同源重組，它是一種分子水平上的定向進化(directed evolution)技術(shù)，它以一個或多個基因為起始材料，通過先隨機斷裂成小片段，再進行互為模板和引物的 PCR（無外加引物），后再進行常規(guī)PCR（外加引物）等處理，后得到含有大量 DNA 重組突變的 PCR 產(chǎn)物。其原理示意圖如下：

本產(chǎn)品就是根據(jù)上述原理優(yōu)化改進而成，它具有下列特點：

1. 即開即用，用戶只需要提供樣品 DNA 模板，無需單獨準(zhǔn)備各成分。

2. 可以用于對長度在 1000bp 的同源片段進行 shuffling。

3. 操作手冊經(jīng)過優(yōu)化，1-2 天即可完成，節(jié)省大量優(yōu)化時間。

4. 本產(chǎn)品足夠 10 次 DNA Shuffling 反應(yīng)，只適用于科研，不能用于臨床。
規(guī)格及成分 成分 編號 十孔盒包裝
PCR MagicMix LM90805 1 mL×3
DNase I 溶液（0.1U/μL） LM90903a 10 μL
DNA Shuffling 試劑盒溶液 A，10× LM131178a 100 μL
DNA Shuffling 試劑盒溶液 B，10× LM131178b 100 μL
超純水 LM100935 1 mL
使用手冊 LM131178sc 1 份

運輸及保存 低溫運輸，-20℃保存，保存期限一年。

自備試劑 待突變基因片段、DNA Shuffling 引物（第二輪 PCR 引物）、膠回收試劑盒。

使用方法 

1. 提前開啟 37℃和 75℃水浴或金屬浴。

2. 待突變基因片段的制備：待突變基因片段可以用多個含同源片段的質(zhì)粒為模板、用 PCR 法或酶切法制備。制備時需保證含起始同源片段（或此同源片段的一部分）的 DNA 片段總長度要比 DNA shuffling 終產(chǎn)物（第二輪 PCR產(chǎn)物）長 200-400 bp，即第二輪 PCR 的引物位置要在此步模板制備引物內(nèi)側(cè) 100-200bp，第二輪 PCR 產(chǎn)物的長度在 1000bp 以下。每次 DNAShuffling 實驗至少需要 2 μg 起始同源片段（如果含兩個以上同源片段，則彼此的比例為 1:1:1），最多可以使用 5 μg 起始同源片段，并且必須通過膠回收的方法回收，以便徹底去除殘留的質(zhì)粒模板、引物和非特異擴增產(chǎn)物等（如果不去除此步的引物，其將對后續(xù) PCR 造成嚴(yán)重干擾）。后需用分光光度法準(zhǔn)確定量，此溶液即為同源片段，放冰上待用。

3. 準(zhǔn)備 DNase I 工作液，將 1 μL 本試劑盒提供的 DNase I 溶液、8uL 超純水、1 μL DNA Shuffling 試劑盒溶液 A 混合得 DNase 工作液，放冰上待用。DNase 工作液必須現(xiàn)配現(xiàn)用。

4. 設(shè)置同源片段碎片化反應(yīng)：在一個 PCR 管中，按順序加入下列成分：

成分 用量

同源片段（來于兩個以上不同基因） 2-5 μg

DNA Shuffling 試劑盒溶液 A，10× 5 μL

DNA Shuffling 試劑盒溶液 B，10× 5 μL

DNase 工作液 2 μL

補超純水到 50 μL

5. 充分輕柔吹打混勻后 37℃水浴 8 分鐘，然后立即放 75℃水浴處理 10 分鐘以滅活 DNase I。

6. 在 2-3%瓊脂糖凝膠上電泳，用常規(guī)的膠回收法回收 25-150 bp 范圍的所有片段，分光光度法精確測定回收片段的濃度。此即為回收片段，放冰上待用。注意：一定要加合適的 DNA marker 以便確定片段范圍。

7. 回收片段重組反應(yīng)：在一干凈 PCR 管中加入 0.5 μg 回收片段、50 μL PCRMix 3.0、補加超純水到 100 μL。反應(yīng)總體積為 100 μL

8. 按下面的 PCR 反應(yīng)參數(shù)進行一輪無引物 PCR：

過程 溫度 時間

PCR 前變性 94℃ 150 s

PCR 反應(yīng)

（40 循環(huán)）

94℃ 30 s

47.5℃ 45 s

72℃ 10 s，每次循環(huán)后增加 5s

PCR 后延伸 72℃ 10 min

9. 取 5-10 μL 進行電泳檢測（本 PCR Mix 含上樣成分，可以直接上樣。紅色示蹤劑的泳動速度相當(dāng)于 50bp DNA），然后對預(yù)期長度區(qū)域的 PCR 產(chǎn)物進行回收（如果 Shuffling 的同源區(qū)域長度為 800bp，則回收 600-1000bp范圍的片段），得到一輪 PCR 回收產(chǎn)物。

10. 留部分一輪 PCR 回收產(chǎn)物之后，用超純水將其分別稀釋 10 倍、20 倍和50 倍，放冰上待用。

11. 取一輪 PCR 回收產(chǎn)物原液、10 倍稀釋液、20 倍稀釋液和 50 倍稀釋液各 1uL 作為 PCR 模板，按下表設(shè)置 4 管第二輪 PCR 反應(yīng)（100μL 體系）。

成分 1-4 號管

PCR 模板（4 種） 各 1 μL（1 號加原液、2 號加 10

倍稀釋液、以此類推）

PCR MagicMix 3.0 50 μL

自備 DNA Shuffling 引物 每管各加 30 pmol

超純水 加到 100 μL

12. 按下列 PCR 參數(shù)進行 PCR：

過程 溫度 時間

活化 94℃ 150 s

PCR 反應(yīng)

（25 次循環(huán)）

94℃ 30 s

47.5℃ 45 s

72℃ 60 s，每次循環(huán)后增加 5s

PCR 后延伸 72℃ 10 min

13. 電泳檢測 4 個 PCR 產(chǎn)物，回收預(yù)期大小的 PCR 產(chǎn)物（根據(jù)引物位置估計預(yù)期大?。?，用于后續(xù)克隆和分析實驗（略）。