動(dòng)物RNAout（TRIzol）

產(chǎn)品及特點(diǎn)
本產(chǎn)品是類(lèi)似于 基于異硫氰酸胍/酚/氯仿提取原理的快速總 RNA 提取試劑，可用于從各種動(dòng)物組織（包括白細(xì)胞）和部分植物材料中 快速提取總 RNA。

1. 操作簡(jiǎn)單快速，只要 10 分鐘左右，可以全在室溫下進(jìn)行。

2. RNA 質(zhì)量高，OD260/OD280 一般在 1.9 左右。一般不含用 RT-PCR 可以檢測(cè)到的基因組 DNA 污染。

3. 適用于大部分實(shí)驗(yàn)材料，如培養(yǎng)細(xì)胞、各種動(dòng)物材料和少數(shù)植物材料。 植物 RNA 的提取好使用天澤基因的植物 RNAOUT。

4. 性價(jià)比高于進(jìn)口 和 TRI Reagent 等同類(lèi)產(chǎn)品。 
規(guī)格及成分 成 份 編 號(hào) 小立盒包裝
動(dòng)物 RNAout LM3070a 100 mL（廣口棕色玻璃瓶 使用手冊(cè) LM3070sc 1 份

運(yùn)輸及保存 常溫運(yùn)輸，4℃保存，有效期一年。

自備試劑 氯仿、異丙醇、75%乙醇、RNase-free 水。 

使用方法

注意：下面的操作步驟是用 1 mL 本產(chǎn)品進(jìn)行的微量提取的，細(xì)胞使用量一 定要準(zhǔn)確，不能超過(guò)下述用量，否則將超出本產(chǎn)品的裂解能力，RNA 產(chǎn)量 將急劇降低。如果樣品量大，請(qǐng)按比例增加各成份的用量。RNA 工作環(huán)境 好用高效無(wú)毒的固相 RNase 清除劑（CAT#：3080）徹底處理。

1. 對(duì)貼壁細(xì)胞（10 平方厘米）：吸盡培養(yǎng)液，加入 1 mL 的本產(chǎn)品用槍充 分吹打確保細(xì)胞全部裂解，然后將裂解液轉(zhuǎn)移至干凈的 1.5 mL 塑料離 心管中，進(jìn)入第 6 步。

2. 對(duì)懸浮細(xì)胞（五百萬(wàn)至一千萬(wàn)個(gè)）：離心收集細(xì)胞，吸盡液體，加入 1 mL 本產(chǎn)品，用槍充分吹打確保細(xì)胞全部裂解，然后將裂解液轉(zhuǎn)移到干凈的 1.5 mL 塑料離心管中，進(jìn)入第 6 步。

3. 對(duì)新鮮組織（50-100 mg）：將新鮮組織剪切成小塊，放入 10 mL 或 15 mL 塑料離心管中，加入 1 mL 的本產(chǎn)品，用 Polytron 剪切式勻漿 器冰上勻漿 30 秒左右，將勻漿液轉(zhuǎn)移至新的 1.5 mL 塑料離心管中， 進(jìn)入第 6 步。注意：對(duì)肝、脾、胰、腎等細(xì)胞分裂十分旺盛的組織（細(xì) 胞中含大量正在復(fù)制的 DNA），使用量不要超過(guò) 30-50 mg，否則十分 容易產(chǎn)生 DNA 污染。對(duì) 10 mg 以下的組織，好加入本公司的微量 RNA 助沉劑。

4. 對(duì) RNALOCKER保存的組織（50-100 mg）：先用紙吸去 RNALOCKER液 體后再剪切成小塊，其余操作同第 3 步。RNALOCKER 處理后的組織韌 性很強(qiáng)，勻漿時(shí)間需要適當(dāng)延長(zhǎng)。

5. 對(duì)液氮中保存的組織（50-100 mg）：在研缽中研磨成粉，加入 1 mL 本產(chǎn)品，用槍充分吹打確保細(xì)胞全部裂解，然后將裂解液轉(zhuǎn)移到干凈的 1.5 mL 塑料離心管中，進(jìn)入第 6 步。

6. 在裝有裂解物/勻漿物的 1.5 mL 塑料離心管中加入 0.2 mL 自備氯仿， 振蕩器上充分振蕩混均 30 秒。注意：一定要把官底的溶液震蕩起來(lái)， 否則只是液面的振動(dòng)。

7. 13000-15000 g 室溫離心 3 分鐘。

8. 將上清液（約 0.6 mL）轉(zhuǎn)移到另一干凈的 1.5 mL 塑料離心管中。下 層有機(jī)相（藍(lán)色）和中間層含有 DNA 和蛋白質(zhì)，避免觸及，否則將產(chǎn) 生蛋白質(zhì)和 DNA 污染。為保險(xiǎn)起見(jiàn)，可以留下 50-100uL 上清液不取。

9. 對(duì)脂類(lèi)豐富的組織（如脂肪組織和腦組織），需再重復(fù)氯仿抽提一到兩 次以讓氯仿充分去除脂類(lèi)分子。

10. 在上清液中加入等體積的異丙醇，振蕩器上振蕩 30 秒混勻。

11. 13000-15000 g 室溫離心 5 分鐘，離心底的側(cè)面將形成 RNA 沉淀。 如果組織使用量低于 10 mg 或需要提高 RNA 回收率，可以將離心時(shí) 間延長(zhǎng)到 20 或 30 分鐘。 

12. 小心吸棄上清液，注意不要吸棄 RNA 沉淀。

13. 在含 RNA 沉淀的離心管中加入 1mL 75%乙醇，振蕩混勻 30 秒。

14. 13000-15000 g 室溫離心 1 分鐘。

15. 小心吸棄上清液，注意不要吸棄 RNA 沉淀。

16. 重復(fù)第 13-15 的洗滌步驟一次（也可以省略）。

17. 短暫快速離心，用移液槍小心吸棄殘留乙醇(約 50 uL)。注意不要吸棄 RNA 沉淀。此步十分重要，否則殘留的乙醇會(huì)影響 RNA 的后續(xù)使用。

18. 室溫放 1-2 分鐘后立即加入 50-100 uL RNase-free 水使 RNA 沉淀溶 解。千萬(wàn)不要用真空離心法使 RNA 沉淀過(guò)于干燥，否則 RNA 將變得 十分難溶。RNA 樣品可以立即使用或存放于-80℃待用。 注意：由于 RNase-free 水沒(méi)有主動(dòng)滅活殘留 RNase 的功能，而任何 方法提取的 RNA 都可能有殘留的 RNase，所以強(qiáng)烈建議客戶使用本公 司推出的具有主動(dòng)滅活殘留 RNase 功能的、同時(shí)跟后續(xù) RT-PCR 等反 應(yīng)兼容的液相 RNase 清除劑（CAT#：3091）。

附一：RNA 完整性的電泳檢測(cè)（僅供參考，本產(chǎn)品不含相關(guān)試劑） 如果需要做 Northern 雜交，強(qiáng)烈建議用戶使用甲醛變性膠進(jìn)行 RNA 電泳，因?yàn)榉亲冃阅z不能分離所有的 RNA 分子（BioTechniques，28： 414，2000）。如果是簡(jiǎn)單檢測(cè)，可以使用 TAE 緩沖液或超快核酸電泳液 進(jìn) 行 常 規(guī)電 泳 ，但 文獻(xiàn) 報(bào) 道 必須 使用 RNAon 這 樣 的變 性 上樣 液 （BioTechniques，9：558，1990）。普通 DNA 上樣液不含變性劑，也 沒(méi)經(jīng)過(guò)去 RNase 處理，所以好不要使用，否則 RNA 容易降解。 動(dòng)物 RNA 電泳后應(yīng)該在 UV 下呈現(xiàn)三條清晰的 rRNA 帶，28S rRNA 條 帶的熒光強(qiáng)度一般比 18S rRNA 條帶的熒光強(qiáng)度強(qiáng) 1.5-2.3 倍。如果這兩 條 rRNA 帶不清晰或比例小于此范圍則表示 RNA 有降解（因?yàn)榇蟮?RNA 被酶降解的可能更大）。 

跟動(dòng)物一樣，植物果實(shí)和種子的 RNA 一般有三條電泳帶，但植物葉片 的 RNA 有四條或更多 rRNA 帶，多余的 RNA 來(lái)源于葉綠體。

如果電泳發(fā)現(xiàn) RNA 樣品中有 DNA 污染（一般是使用過(guò)多樣品造成）， 可分別用天澤基因的非酶 DNA 清除劑或 RNase-free DNase 清除。

附二：RNA 產(chǎn)量和純度測(cè)定（僅供參考，本產(chǎn)品不含相關(guān)試劑）

用 pH 在 7.5-8.2 的 TE 緩沖液將 5-10 μL RNA 稀釋 10-20 倍后在 OD260 和 OD260 測(cè)光吸收，通過(guò)光吸收可以得出 RNA 濃度（1 OD260 的 RNA=40 μg/mL），進(jìn)而計(jì)算出 RNA 的產(chǎn)量（濃度×體積)和產(chǎn)率(RNA 產(chǎn)量/組織用量)。RNA 的產(chǎn)率還隨組織的營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)和組織的種類(lèi)不同而不 同，一般來(lái)說(shuō)，代謝旺盛的組織(如肝臟和腎臟)RNA 的產(chǎn)率高，代謝不旺盛 的組織(如肌肉和脂肪組織)RNA 的產(chǎn)率低，下面是常見(jiàn)動(dòng)物組織 RNA 產(chǎn)率: 肌肉，胎盤(pán)和腦組織:1-2 μg RNA/mg 組織 肝，胰和腎組織: 5-10 μg RNA/mg 組織 培養(yǎng)細(xì)胞: 5-15 μg/10E6 細(xì)胞 RNA 的純度通過(guò) OD260/OD280 來(lái)確定，一般在 1.8-2.1 之間即算 合格。但即使低于此范圍，一般也不會(huì)影響 RT-PCR 等反應(yīng)。

蛋白質(zhì)污染可以通過(guò)酚/氯仿抽提一次然后酒精沉淀去除，多糖污染可 以用天澤基因的多糖清除劑去除。 關(guān)聯(lián)產(chǎn)品 RNADOWN、、液相 RNase 清除劑、固相 RNase