柱式細(xì)菌RNAout

產(chǎn)品及特點

本產(chǎn)品是細(xì)菌 RNAout (CAT#:51102)的柱式升級產(chǎn)品，用于快速從各種常見的中提取總 RNA。跟細(xì)菌 RNAout 相比 它具有下列特點:

1. 操作更加簡單快速，省去了最費時的離心步驟。一般只需 30-40 分鐘完成。

2. 既可用于革氏陰性細(xì)菌，也可用于革氏陽性細(xì)菌。

3. 所得 RNA 純度更高，OD260/OD280 一般在 2.0 左右. 4. 一般不含基因 DNA 和蛋白污染。

5. 性價比高于進(jìn)口同類產(chǎn)品，適用于各種革氏陰性細(xì)菌。

6. 可用于后續(xù) RT-PCR、Northern Blot、芯片分析、體外翻譯、polyA篩選和 RNase 保護(hù)分析等試驗。
規(guī)格及成分 成 份 編 號 大紙盒包裝 
柱式細(xì)菌 RNAout 溶液 A LM80103a 25 mL 柱式細(xì)菌 RNAout 溶液 B LM80103b 25 mL 溶菌酶干粉 LM80103c 30 mg 離心吸附柱 60911 50 套 通用洗柱液 60408 50 mL RNA 洗脫液 71207 10 mL 使用手冊 80104sc 1 份

運輸及保存 常溫運輸，收到貨后，溶液 A 長期保存需要放 4℃，溶菌酶干粉長期保存需要放-20℃，有效期一年。 

自備試劑 氯仿。

使用方法 

注意：試驗所用的實驗室環(huán)境、耗材等均需要 RNase-free。操作步驟是針對在 1.5 mL 塑料離心管中進(jìn)行的微量提取。

1. 新鮮配制溶菌酶溶液：根據(jù)樣品數(shù)量用自備的 TE 緩沖液和本試劑盒提供的溶菌酶干粉配制合適體積的、濃度為 4mg/mL 的溶菌酶溶液，放冰上待用。一次革氏陽性細(xì)菌 RNA 小量提取需要 100uL 溶菌酶溶液，一次革氏陰性細(xì)菌 RNA 小量提取需要 10uL 溶菌酶溶液。未用完的溶菌酶溶液不建議保存后重復(fù)使用。

2. 在 1.5 mL 塑料離心管中離心收集 0.2-1.5 mL 新鮮細(xì)菌（細(xì)菌總數(shù)不得超過 1×10E9 個細(xì)菌）。注意:由于細(xì)菌 RNA 半衰期十分短，只有2-5 分鐘，所以必須使用新鮮的、處于對數(shù)生長期的細(xì)菌才能提到高質(zhì)量的 RNA。細(xì)菌必須立即使用，不能靜置。

3. 吸盡液體培養(yǎng)基，如果是革氏陽性細(xì)菌，則加入 100uL 第 1 步制備的4mg/mL 的溶菌酶溶液，徹底重懸細(xì)菌，常溫放置 5-10 分鐘。如果是革氏陰性細(xì)菌，則加入 90uL TE 緩沖液和 10uL 第 1 步制備的 4mg/mL的溶菌酶溶液，徹底重懸細(xì)菌，常溫放置 3-5 分鐘。

4. 加入 0.3mL 溶液 A，用槍充分吹打細(xì)菌沉淀，確保細(xì)菌全部裂解，沒有塊狀物。此時裂解物總體積是 0.4mL。

5. 加入約 0.2 倍體積的自備氯仿(10.4mL 裂解物需 0.1 mL 氯仿)，振蕩器上充分振蕩混均 30 秒。

6. 12000-15000 g 室溫離心 3 分鐘。

7. 將上清液（約 0.3mL）轉(zhuǎn)移到離心吸附柱中。注意：離心后下層有機相和中間層含有 DNA 和蛋白質(zhì)，避免觸及，否則將產(chǎn)生蛋白質(zhì)和 DNA 污染。

8. 加入等體積（約 0.3mL）的溶液 B，充分混勻后全部上柱。

9. 12000-15000 g 室溫離心半分鐘，棄收集管中的穿透液。

10. 加 0.7 mL 通用洗柱液到離心吸附柱中，室溫離心半分鐘，棄收集管中的 穿透液。一次洗滌一般足夠去除雜質(zhì)。但如果樣品 OD260/280 比值不高，可以再用 0.3 mL 通用洗柱液重復(fù)此步一次。

11. 室溫 12000-15000 g 離心半分鐘。此步十分重要，否則殘留的通用洗柱液會影響 RNA 的使用。

12. 將離心吸附柱轉(zhuǎn)移到一自備的 RNase-free 收集管中，加入 30-100 uLRNA 洗脫液，室溫放置兩分鐘。

13. 室溫離心半分鐘，離心管中溶液即為 RNA 樣品，可以立即使用或存放于-80℃待用。

14. RNA 完整性的電泳檢測：如果需要做 Northern 雜交，強烈建議用戶使用甲醛變性膠進(jìn)行 RNA 電泳，因為非變性膠不能分離所有的 RNA 分子（BioTechniques，28：414，2000）。

15. RNA 產(chǎn)量產(chǎn)率測定：將 5-10 μL RNA 溶于 TE 緩沖液中(pH7.5-8.2 之間)檢測其在 OD260 的光吸收。通過光吸收可以得出 RNA 濃度（1OD260 的 RNA=40 μg/mL），進(jìn)而計算出 RNA 的產(chǎn)量（濃度 X 體積)和產(chǎn)率(RNA 產(chǎn)量/組織用量)。

16. RNA 純度測定：無污染的總 RNA 的 OD260/OD280 一般在 1.8-2.1之間(具體數(shù)值與其堿基組成和溶液成分等多種因素有關(guān))，高于此范圍則分別表示樣品可能有蛋白質(zhì)污染，但一般不影響 RT-PCR 等反應(yīng)。