??????碧云天的Rat TNF-α ELISA Kit (Rat Tumor Necrosis Factor-α Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay Kit)，即大鼠腫瘤壞死因子-α酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)試劑盒，是一種用于特異性地高靈敏地定量檢測(cè)大鼠血清、血漿、細(xì)胞或組織裂解液、或細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的TNF-α的試劑盒。
??????本產(chǎn)品檢測(cè)靈敏度高，特異性強(qiáng)，重復(fù)性好。多次重復(fù)檢測(cè)結(jié)果表明，最小檢出量為26pg/ml，與GDNF、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-4、PDGF-BB、IL-10、人TNF-α、小鼠TNF-α等均沒(méi)有交叉反應(yīng)，板內(nèi)、板間變異系數(shù)均小于10%。
??????TNF-α，即TNF、TNFα或TNFalpha，也稱cachectin、cachexin或TNFSF1A。TNF-α由巨噬細(xì)胞、上皮細(xì)胞等多種細(xì)胞在細(xì)菌感染、內(nèi)毒素刺激、病毒或寄生蟲(chóng)感染時(shí)產(chǎn)生。腫瘤壞死因子超家族(Tumor necrosis factor superfamily)共約19個(gè)成員，包含由巨噬細(xì)胞等產(chǎn)生的TNF-α和T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的TNF-β(也稱Lymphotoxin-alpha)，以及FASL、TRAIL、CD40L、CD27L、CD30L等。TNF-α與TNF-β在結(jié)構(gòu)上有一定的相似性，并且在氨基酸水平有28%的同源性，它們擁有共同的受體TNFR1和TNFR2。由于TNF-α的生物學(xué)活性占TNF總活性的70%~95%，因此目前常說(shuō)的TNF多指TNF-α。TNF (Tumor Necrosis Factor)因?yàn)槟苷T導(dǎo)細(xì)胞死亡而得名，實(shí)際上其很多時(shí)候誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡為細(xì)胞凋亡。人TNF-α有兩種形式，一種是由233個(gè)氨基酸組成的跨膜蛋白同源三聚體(homotrimers)，另外一種是該跨膜蛋白在TNF-α轉(zhuǎn)化酶TACE(TNF-α converting enzyme)的作用下切除信號(hào)肽，形成成熟的157個(gè)氨基酸的可溶性TNF-α單體(分子量為17KDa)的同源三聚體。無(wú)論TNF-α的跨膜同源三聚體還是可溶性同源三聚體(51kD)，都具有生物學(xué)活性，但活性的差異目前仍有爭(zhēng)議。小鼠和人的TNF-α有約79%的氨基酸同源性，也同樣形成同源三聚體發(fā)揮作用。TNF-α可以誘導(dǎo)產(chǎn)生炎癥反應(yīng)、發(fā)燒(fever)、細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤形成和病毒復(fù)制等。TNF-α也參與了包括哮喘、克羅恩氏病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、神經(jīng)性疼痛、阿茲海默癥、肥胖癥、II型糖尿病、自身免疫病和腫瘤等疾病的發(fā)生發(fā)展。

圖1. TNF-α的信號(hào)通路示意圖

??????TNF-α被誘導(dǎo)分泌后，其同源三聚體與受體TNFR1(TNF receptor, type I)或TNFR2(TNF receptor, type II)結(jié)合而引發(fā)其下游信號(hào)通路的一系列反應(yīng)。TNF-α的信號(hào)通路參見(jiàn)圖1。TNFR1在大多數(shù)組織中有表達(dá)，而TNFR2主要在免疫細(xì)胞中表達(dá)。TNF-α的跨膜同源三聚體和可溶性同源三聚體都可以完全激活TNFR1，而TNFR2僅對(duì)TNF-α的跨膜同源三聚體產(chǎn)生響應(yīng)。
??????本試劑盒采用雙抗體夾心ELISA法(Sandwich ELISA)檢測(cè)樣品中靶蛋白的的濃度，其原理見(jiàn)圖2。靶蛋白特異的單克隆捕獲抗體已預(yù)包被于酶標(biāo)板上，當(dāng)加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣品時(shí)，其中的靶蛋白會(huì)與捕獲抗體結(jié)合。當(dāng)加入生物素化的抗靶蛋白抗體后，生物素化抗靶蛋白抗體與靶蛋白結(jié)合，形成夾心的免疫復(fù)合物。隨后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記Streptavidin(HRP-Streptavidin)，由于生物素與鏈霉親和素(Streptavidin)可以特異性地結(jié)合，因此鏈霉親和素連接的HRP就會(huì)與夾心的免疫復(fù)合物連接起來(lái)而被固相捕獲。最后加入顯色劑TMB溶液，固相捕獲的辣根過(guò)氧化物酶就會(huì)催化無(wú)色的顯色劑氧化成藍(lán)色物質(zhì)，在加入終止液后呈黃色。通過(guò)酶標(biāo)儀檢測(cè)450nm處的吸光度值就能實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)。靶蛋白濃度與A450值呈正比，通過(guò)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)照樣品吸光度值，即可計(jì)算出樣品中靶蛋白濃度。

圖2. 雙抗體夾心ELISA原理圖。

??????一個(gè)包裝的本試劑盒，包括標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)，可以進(jìn)行96次檢測(cè)。
包裝清單：

保存條件：
??????除標(biāo)準(zhǔn)品外，4℃保存6個(gè)月內(nèi)有效。標(biāo)準(zhǔn)品4℃保存，1-2周內(nèi)有效，-20℃保存6個(gè)月內(nèi)有效。注意TMB溶液避光保存。
注意事項(xiàng)：
??????由于標(biāo)準(zhǔn)品一般是凍干粉，在制備后需要嚴(yán)格校準(zhǔn)，所以標(biāo)準(zhǔn)品的瓶數(shù)及每瓶標(biāo)準(zhǔn)品所需加入的稀釋液體積請(qǐng)以實(shí)際收到的試劑盒及標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)簽上的標(biāo)注為準(zhǔn)。
??????洗滌液(20X)在低溫下可能有結(jié)晶，如果發(fā)現(xiàn)有結(jié)晶，請(qǐng)室溫水浴加熱使結(jié)晶完全溶解后再配制工作液。
??????為保證標(biāo)準(zhǔn)品的精確性，標(biāo)準(zhǔn)品配制使用后，如果有剩余請(qǐng)勿再次使用。
??????TMB對(duì)人體有刺激性，請(qǐng)注意適當(dāng)防護(hù)。
??????如果發(fā)現(xiàn)TMB辣根過(guò)氧化物酶顯色液出現(xiàn)混濁或顏色變成藍(lán)色，應(yīng)該停止使用。
??????加樣時(shí)，請(qǐng)注意每個(gè)樣品或標(biāo)準(zhǔn)品必須更換槍頭，一方面避免交叉污染，另一方面也避免吸取體積的誤差。
??????不宜混用不同批號(hào)的試劑盒組份，每批次試劑盒均經(jīng)過(guò)獨(dú)立測(cè)試。
??????充分混勻?qū)ΡＷC反應(yīng)結(jié)果的精準(zhǔn)性很重要，在加液后請(qǐng)輕輕晃動(dòng)整個(gè)96孔板，以保證混勻。
??????本試劑盒很多操作在室溫進(jìn)行，要求嚴(yán)格控制室溫在25-28℃。溫度低于25℃會(huì)導(dǎo)致最終檢測(cè)到的吸光度顯著下降。
??????洗滌過(guò)程非常重要，洗滌不充分會(huì)使精確度下降并導(dǎo)致結(jié)果誤差較大。
??????檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品時(shí)建議設(shè)置重復(fù)孔，以確保檢測(cè)結(jié)果的可信度。
??????加樣過(guò)程中須避免氣泡的產(chǎn)生。
??????本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
??????為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。