Mouse TNF-α ELISA Kit

康朗生物的Mouse TNF-α ELISA Kit (Mouse Tumor Necrosis Factor-α Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay Kit)，即小鼠腫瘤壞死因子-α酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒，是一種用于特異性地高靈敏地定量檢測小鼠血清、血漿、細(xì)胞或組織裂解液、或細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的TNF-α的試劑盒。
本產(chǎn)品檢測靈敏度高，特異性強(qiáng)，重復(fù)性好。多次重復(fù)檢測結(jié)果表明，最小檢出量為4.9pg/ml，與人TNF-α、sTNF RIs、TNF RII等均沒有交叉反應(yīng)，板內(nèi)、板間變異系數(shù)均小于10%。
TNF-α，即TNF、TNFα或TNFalpha，也稱cachectin、cachexin或TNFSF1A。TNF-α由巨噬細(xì)胞、上皮細(xì)胞等多種細(xì)胞在細(xì)菌感染、內(nèi)毒素刺激、病毒或寄生蟲感染時產(chǎn)生。腫瘤壞死因子超家族(Tumor necrosis factor superfamily)共約19個成員，包含由巨噬細(xì)胞等產(chǎn)生的TNF-α和T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的TNF-β(也稱Lymphotoxin-alpha)，以及FASL、TRAIL、CD40L、CD27L、CD30L等。TNF-α與TNF-β在結(jié)構(gòu)上有一定的相似性，并且在氨基酸水平有28%的同源性，它們擁有共同的受體TNFR1和TNFR2。由于TNF-α的生物學(xué)活性占TNF總活性的70%~95%，因此目前常說的TNF多指TNF-α。TNF (Tumor Necrosis Factor)因為能誘導(dǎo)細(xì)胞死亡而得名，實際上其很多時候誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡為細(xì)胞凋亡。人TNF-α有兩種形式，一種是由233個氨基酸組成的跨膜蛋白同源三聚體(homotrimers)，另外一種是該跨膜蛋白在TNF-α轉(zhuǎn)化酶TACE(TNF-α converting enzyme)的作用下切除信號肽，形成成熟的157個氨基酸的可溶性TNF-α單體(分子量為17KDa)的同源三聚體。無論TNF-α的跨膜同源三聚體還是可溶性同源三聚體(51kD)，都具有生物學(xué)活性，但活性的差異目前仍有爭議。小鼠和人的TNF-α有約79%的氨基酸同源性，也同樣形成同源三聚體發(fā)揮作用。TNF-α可以誘導(dǎo)產(chǎn)生炎癥反應(yīng)、發(fā)燒(fever)、細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤形成和病毒復(fù)制等。TNF-α也參與了包括哮喘、克羅恩氏病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、神經(jīng)性疼痛、阿茲海默癥、肥胖癥、II型糖尿病、自身免疫病和腫瘤等疾病的發(fā)生發(fā)展。

圖1. TNF-α的信號通路示意圖

TNF-α被誘導(dǎo)分泌后，其同源三聚體與受體TNFR1(TNF receptor, type I)或TNFR2(TNF receptor, type II)結(jié)合而引發(fā)其下游信號通路的一系列反應(yīng)。TNF-α的信號通路參見圖1。TNFR1在大多數(shù)組織中有表達(dá)，而TNFR2主要在免疫細(xì)胞中表達(dá)。TNF-α的跨膜同源三聚體和可溶性同源三聚體都可以完全激活TNFR1，而TNFR2僅對TNF-α的跨膜同源三聚體產(chǎn)生響應(yīng)。
      本試劑盒采用雙抗體夾心ELISA法(Sandwich ELISA)檢測樣品中靶蛋白的的濃度，其原理見圖2。靶蛋白特異的單克隆捕獲抗體已預(yù)包被于酶標(biāo)板上，當(dāng)加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣品時，其中的靶蛋白會與捕獲抗體結(jié)合。當(dāng)加入生物素化的抗靶蛋白抗體后，生物素化抗靶蛋白抗體與靶蛋白結(jié)合，形成夾心的免疫復(fù)合物。隨后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記Streptavidin(HRP-Streptavidin)，由于生物素與鏈霉親和素(Streptavidin)可以特異性地結(jié)合，因此鏈霉親和素連接的HRP就會與夾心的免疫復(fù)合物連接起來而被固相捕獲。最后加入顯色劑TMB溶液，固相捕獲的辣根過氧化物酶就會催化無色的顯色劑氧化成藍(lán)色物質(zhì)，在加入終止液后呈黃色。通過酶標(biāo)儀檢測450nm處的吸光度值就能實現(xiàn)定量檢測。靶蛋白濃度與A450值呈正比，通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，對照樣品吸光度值，即可計算出樣品中靶蛋白濃度。

圖2. 雙抗體夾心ELISA原理圖。

一個包裝的本試劑盒，包括標(biāo)準(zhǔn)品檢測，可以進(jìn)行96次檢測。
保存條件：
除標(biāo)準(zhǔn)品外，4℃保存6個月內(nèi)有效。標(biāo)準(zhǔn)品4℃保存，1-2周內(nèi)有效，-20℃保存6個月內(nèi)有效。注意TMB溶液避光保存。
注意事項：
由于標(biāo)準(zhǔn)品一般是凍干粉，在制備后需要嚴(yán)格校準(zhǔn)，所以標(biāo)準(zhǔn)品的瓶數(shù)及每瓶標(biāo)準(zhǔn)品所需加入的稀釋液體積請以實際收到的試劑盒及標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)簽上的標(biāo)注為準(zhǔn)。
洗滌液(20X)在低溫下可能有結(jié)晶，如果發(fā)現(xiàn)有結(jié)晶，請室溫水浴加熱使結(jié)晶完全溶解后再配制工作液。
為保證標(biāo)準(zhǔn)品的精確性，標(biāo)準(zhǔn)品配制使用后，如果有剩余請勿再次使用。

特別提示：本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實驗，嚴(yán)禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途！
TMB對人體有刺激性，操作時請小心，并注意適當(dāng)防護(hù)以避免直接接觸人體或吸入體內(nèi)。
如果發(fā)現(xiàn)TMB辣根過氧化物酶顯色液出現(xiàn)混濁或顏色變成藍(lán)色，應(yīng)該停止使用。
加樣時，請注意每個樣品或標(biāo)準(zhǔn)品必須更換槍頭，一方面避免交叉污染，另一方面也避免吸取體積的誤差。
不宜混用不同批號的試劑盒組份，每批次試劑盒均經(jīng)過獨(dú)立測試。
充分混勻?qū)ΡＷC反應(yīng)結(jié)果的精準(zhǔn)性很重要，在加液后請輕輕晃動整個96孔板，以保證混勻。
本試劑盒很多操作在室溫進(jìn)行，要求嚴(yán)格控制室溫在25-28℃。溫度低于25℃會導(dǎo)致最終檢測到的吸光度顯著下降。
洗滌過程非常重要，洗滌不充分會使精確度下降并導(dǎo)致結(jié)果誤差較大。
檢測標(biāo)準(zhǔn)品和樣品時建議設(shè)置重復(fù)孔，以確保檢測結(jié)果的可信度。
加樣過程中須避免氣泡的產(chǎn)生。
本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

使用說明：
1. 樣品準(zhǔn)備
a. 樣品的準(zhǔn)備請按下列流程進(jìn)行操作：
(a) 細(xì)胞上清樣品離心取上清即可(如100-500g，5分鐘)。
(b) 對于血清樣品，將全血在室溫下放置30分鐘至2小時，不要劇烈搖晃以免溶血，待全血自然凝固并析出血清后，4℃約1000-2000g離心10分鐘，取黃色上清即得血清，注意不要吸取白色或淡黃色沉淀。制備好的血清需置于冰上待用。
(c) 對于血漿樣品，采集的全血使用肝素或者EDTA進(jìn)行抗凝處理，混勻后置冰上，4℃約1000-2000g離心10分鐘，取黃色或淡黃色上清即得血漿，注意不要吸取白色沉淀。制備好的血漿需置于冰上待用。
(d) 若待測樣品不能及時檢測，樣品制備后請分裝，凍存于-20℃或-80℃，并注意避免反復(fù)凍融。
b. 血清樣品不應(yīng)添加任何防腐劑或抗凝劑。
c. 樣品應(yīng)清澈透明，檢測前樣品中如有懸浮物應(yīng)通過離心去除。
d. 請勿使用溶血、高血脂或污染的樣品檢測，否則結(jié)果將不準(zhǔn)確。
注：小鼠血清或血漿樣品可能需要用樣品分析緩沖液適當(dāng)稀釋后再檢測。
2. 檢測前準(zhǔn)備工作
a. 試劑盒從冰箱中取出后應(yīng)置室溫(25-28℃)平衡20分鐘；每次檢測后剩余試劑請及時置于4℃保存。
b. 配制適當(dāng)量的洗滌液：將洗滌液(20X)用雙蒸水或去離子水稀釋至1X，例如10ml洗滌液(20X)加190ml水混勻后即為1X的洗滌液。
c. 按標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)簽上標(biāo)注的體積加入標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液至1瓶標(biāo)準(zhǔn)品中，室溫孵育15分鐘(為確保標(biāo)準(zhǔn)曲線的準(zhǔn)確性，切勿縮短孵育時間)。隨后輕輕混勻并用移液槍吹打幾次使標(biāo)準(zhǔn)品徹底溶解，使標(biāo)準(zhǔn)品終濃度達(dá)到2000pg/ml。通常每個濃度的標(biāo)準(zhǔn)品需要檢測2個孔，每個孔的標(biāo)準(zhǔn)品用量為100μl，共需200μl，同時稀釋時還需要使用250μl，因此如果1瓶標(biāo)準(zhǔn)品配制后的體積不足0.45ml，請使用更多瓶數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品，并在合并混勻后使用。
d. 取5個潔凈的1.5毫升離心管，每管預(yù)先加入250μl的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，并參考圖3進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品的倍比稀釋，最終得到2000、1000、500、250、125、62.5pg/ml共六個標(biāo)準(zhǔn)品濃度，最后將稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品依次加入預(yù)包被板孔中，標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液直接加入作為0pg/ml濃度，共七個標(biāo)準(zhǔn)品濃度。

圖3. 標(biāo)準(zhǔn)品倍比稀釋示意圖。按標(biāo)準(zhǔn)品(STANDARD)標(biāo)簽上標(biāo)注體積加入標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液溶解并混勻后的濃度為標(biāo)準(zhǔn)品的起始濃度。其它的倍比稀釋后的濃度依次為起始濃度的1/2、1/4、1/8、1/16和1/32。

3. 洗滌方法
自動洗板機(jī)或手工洗板：每孔洗滌液為300μl，注入與吸出間隔15-30秒。洗板5次。最后一次洗板完成后將板倒扣在厚吸水紙上適當(dāng)用力拍干。
4. 實驗過程需自備的材料和儀器
a. 不同規(guī)格的移液槍及相應(yīng)的吸頭
b. 酶標(biāo)儀
c. 自動洗板機(jī)(如果沒有也可以手工洗板)
d. 去離子水或雙蒸水
5. 操作步驟
a. 計算并確定一次實驗所需的預(yù)包被板條數(shù)，取出所需板條放置在96孔框架內(nèi)，暫時用不到板條請放回鋁箔袋密封，保存于4℃。
b. 每次實驗都需配制標(biāo)準(zhǔn)品并繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，同時建議設(shè)置本底較正孔，即空白孔，設(shè)置方法為該孔只加TMB溶液和終止液。
c. 分別將樣品或不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品按照100μl/孔加入相應(yīng)孔中，用封板膜(透明)封住反應(yīng)孔，室溫孵育120分鐘。對于血清或血漿樣品，可以加入50μl樣品分析緩沖液后加50μl樣品；如稀釋比例大，將樣品與樣品分析緩沖液等量加入，不足部分用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液補(bǔ)充至100μl。請注意記錄好樣品的稀釋倍數(shù)。
注意：請先查閱相關(guān)文獻(xiàn)確定樣品中待檢測蛋白的大致濃度，如果該濃度大于或者小于本試劑盒的最高或者最低標(biāo)準(zhǔn)品濃度，請適當(dāng)稀釋或濃縮后再進(jìn)行檢測。
d. 洗板5次，且最后一次置于厚吸水紙上拍干。
e. 加入生物素化抗體100μl/孔(注：此生物素化抗體已經(jīng)預(yù)先配制好，可以直接使用，不必再進(jìn)行稀釋)。用封板膜(透明)封住反應(yīng)孔，室溫孵育60分鐘。
f. 洗板5次，且最后一次置于厚吸水紙上拍干。
g. 加入辣根過氧化物酶標(biāo)記Streptavidin 100μl/孔。用封板膜(白色)封住反應(yīng)孔，室溫避光孵育20分鐘。室溫偏低時(低于25℃)，需要適當(dāng)延長孵育時間。
h. 洗板5次，且最后一次置于厚吸水紙上拍干。
i. 加入顯色劑TMB溶液100μl/孔，用封板膜(白色)封住反應(yīng)孔，室溫避光孵育20分鐘。室溫偏低時需要適當(dāng)延長孵育時間，此時可以孵育至標(biāo)準(zhǔn)品和樣品出現(xiàn)非常顯著的顏色變化。
j. 加入終止液50μl/孔，混勻后立即測量A450值。
6. 結(jié)果分析
a. 復(fù)孔的值通常在20%的差異范圍內(nèi)結(jié)果才有效，復(fù)孔平均值可作為測量值。
b. 每個標(biāo)準(zhǔn)品或樣品的吸光度值應(yīng)減去本底校正孔的吸光度值(如果沒有做校正孔，則不需要減去)。
c. 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，A450值為縱坐標(biāo)，以平滑線連接各標(biāo)準(zhǔn)品的坐標(biāo)點(diǎn)。通過樣品的吸光度值和標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出樣品的相應(yīng)濃度。

圖4. Mouse TNF-α ELISA Kit的標(biāo)準(zhǔn)曲線。實測數(shù)據(jù)會因?qū)嶒灄l件、檢測儀器等的不同而存在差異，圖中數(shù)據(jù)僅供參考。

d. 若樣品OD值高于標(biāo)準(zhǔn)曲線上限，應(yīng)適當(dāng)稀釋后重新測定，計算濃度時需注意乘以樣品的稀釋倍數(shù)。