??????碧云天的Human TNF-α ELISA Kit (Human Tumor Necrosis Factor-α Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay Kit)，即人腫瘤壞死因子-α酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒，是一種用于特異性地高靈敏地定量檢測人血清、血漿、細胞或組織裂解液、或細胞培養(yǎng)上清液中的TNF-α的試劑盒。
??????本產(chǎn)品檢測靈敏度高，特異性強，重復(fù)性好。多次重復(fù)檢測結(jié)果表明，最小檢出量為4.3pg/ml，與人TNF-β、sTNF、小鼠TNF-α、RI sTNF、RII sTNF和大鼠TNF-α等均沒有交叉反應(yīng)，板內(nèi)、板間變異系數(shù)均小于10%。
??????TNF-α，即TNF、TNFα或TNFalpha，也稱cachectin、cachexin或TNFSF1A。TNF-α由巨噬細胞、上皮細胞等多種細胞在細菌感染、內(nèi)毒素刺激、病毒或寄生蟲感染時產(chǎn)生。腫瘤壞死因子超家族(Tumor necrosis factor superfamily)共約19個成員，包含由巨噬細胞等產(chǎn)生的TNF-α和T淋巴細胞產(chǎn)生的TNF-β(也稱Lymphotoxin-alpha)，以及FASL、TRAIL、CD40L、CD27L、CD30L等。TNF-α與TNF-β在結(jié)構(gòu)上有一定的相似性，并且在氨基酸水平有28%的同源性，它們擁有共同的受體TNFR1和TNFR2。由于TNF-α的生物學(xué)活性占TNF總活性的70%~95%，因此目前常說的TNF多指TNF-α。TNF (Tumor Necrosis Factor)因為能誘導(dǎo)細胞死亡而得名，實際上其很多時候誘導(dǎo)的細胞死亡為細胞凋亡。人TNF-α有兩種形式，一種是由233個氨基酸組成的跨膜蛋白同源三聚體(homotrimers)，另外一種是該跨膜蛋白在TNF-α轉(zhuǎn)化酶TACE(TNF-α converting enzyme)的作用下切除信號肽，形成成熟的157個氨基酸的可溶性TNF-α單體(分子量為17KDa)的同源三聚體。無論TNF-α的跨膜同源三聚體還是可溶性同源三聚體(51kD)，都具有生物學(xué)活性，但活性的差異目前仍有爭議。小鼠和人的TNF-α有約79%的氨基酸同源性，也同樣形成同源三聚體發(fā)揮作用。TNF-α可以誘導(dǎo)產(chǎn)生炎癥反應(yīng)、發(fā)燒(fever)、細胞凋亡、抑制腫瘤形成和病毒復(fù)制等。TNF-α也參與了包括哮喘、克羅恩氏病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、神經(jīng)性疼痛、阿茲海默癥、肥胖癥、II型糖尿病、自身免疫病和腫瘤等疾病的發(fā)生發(fā)展。

圖1. TNF-α的信號通路示意圖

??????TNF-α被誘導(dǎo)分泌后，其同源三聚體與受體TNFR1(TNF receptor, type I)或TNFR2(TNF receptor, type II)結(jié)合而引發(fā)其下游信號通路的一系列反應(yīng)。TNF-α的信號通路參見圖1。TNFR1在大多數(shù)組織中有表達，而TNFR2主要在免疫細胞中表達。TNF-α的跨膜同源三聚體和可溶性同源三聚體都可以完全激活TNFR1，而TNFR2僅對TNF-α的跨膜同源三聚體產(chǎn)生響應(yīng)。
??????本試劑盒采用雙抗體夾心ELISA法(Sandwich ELISA)檢測樣品中靶蛋白的的濃度，其原理見圖2。靶蛋白特異的單克隆捕獲抗體已預(yù)包被于酶標板上，當(dāng)加入標準品或樣品時，其中的靶蛋白會與捕獲抗體結(jié)合。當(dāng)加入生物素化的抗靶蛋白抗體后，生物素化抗靶蛋白抗體與靶蛋白結(jié)合，形成夾心的免疫復(fù)合物。隨后加入辣根過氧化物酶標記Streptavidin(HRP-Streptavidin)，由于生物素與鏈霉親和素(Streptavidin)可以特異性地結(jié)合，因此鏈霉親和素連接的HRP就會與夾心的免疫復(fù)合物連接起來而被固相捕獲。最后加入顯色劑TMB溶液，固相捕獲的辣根過氧化物酶就會催化無色的顯色劑氧化成藍色物質(zhì)，在加入終止液后呈黃色。通過酶標儀檢測450nm處的吸光度值就能實現(xiàn)定量檢測。靶蛋白濃度與A450值呈正比，通過繪制標準曲線，對照樣品吸光度值，即可計算出樣品中靶蛋白濃度。

圖2. 雙抗體夾心ELISA原理圖。

??????一個包裝的本試劑盒，包括標準品檢測，可以進行96次檢測。
包裝清單：

保存條件：
??????除標準品外，4℃保存6個月內(nèi)有效。標準品4℃保存，1-2周內(nèi)有效，-20℃保存6個月內(nèi)有效。注意TMB溶液避光保存。
注意事項：
??????由于標準品一般是凍干粉，在制備后需要嚴格校準，所以標準品的瓶數(shù)及每瓶標準品所需加入的稀釋液體積請以實際收到的試劑盒及標準品標簽上的標注為準。
??????洗滌液(20X)在低溫下可能有結(jié)晶，如果發(fā)現(xiàn)有結(jié)晶，請室溫水浴加熱使結(jié)晶完全溶解后再配制工作液。
??????為保證標準品的精確性，標準品配制使用后，如果有剩余請勿再次使用。
??????TMB對人體有刺激性，請注意適當(dāng)防護。
??????如果發(fā)現(xiàn)TMB辣根過氧化物酶顯色液出現(xiàn)混濁或顏色變成藍色，應(yīng)該停止使用。
??????加樣時，請注意每個樣品或標準品必須更換槍頭，一方面避免交叉污染，另一方面也避免吸取體積的誤差。
??????不宜混用不同批號的試劑盒組份，每批次試劑盒均經(jīng)過獨立測試。
??????充分混勻?qū)ΡＷC反應(yīng)結(jié)果的精準性很重要，在加液后請輕輕晃動整個96孔板，以保證混勻。
??????本試劑盒很多操作在室溫進行，要求嚴格控制室溫在25-28℃。溫度低于25℃會導(dǎo)致最終檢測到的吸光度顯著下降。
??????洗滌過程非常重要，洗滌不充分會使精確度下降并導(dǎo)致結(jié)果誤差較大。
??????檢測標準品和樣品時建議設(shè)置重復(fù)孔，以確保檢測結(jié)果的可信度。
??????加樣過程中須避免氣泡的產(chǎn)生。
??????本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
??????為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。