操作方法：
一、組織樣本提取
1．向1.5ml EP管中加入300μl miRNA Reagent A。植物組織則再加入10μl β-巰基乙醇，混合均勻。
2．在液氮條件下充分將組織研磨粉碎，將一定的樣品量（見(jiàn)樣本使用量表）研磨成粉狀的組織加入到上述300μl miRNAReagent A中，立即手腕用力震蕩至組織粉末徹底溶解于裂解液中。室溫靜置 5分鐘 以充分裂解細(xì)胞。
  注意：將組織加入到 miRNA Reagent A 后要迅速將組織震散，否則易引起組織成團(tuán)狀，不容易裂解。如發(fā)生成團(tuán)狀，務(wù)必用移液器將團(tuán)狀組織吹打松散。
3．向上述裂解完畢的裂解液中加入350μl miRNA Reagent B，上下顛倒混合均勻。13000rpm離心5分鐘，吸取550μl上清液，轉(zhuǎn)移到新的1.5ml EP管中。
4．向上述溶液中加入200μl無(wú)水乙醇，手腕用力震蕩數(shù)次，室溫放置 5分鐘。
5．13000rpm離心10分鐘，轉(zhuǎn)移700μl上清液到新的1.5ml EP管中。
6．向上述溶液中加入300μl 異丙醇，手腕用力上下顛倒數(shù)次。
7．分兩次將上述溶液倒入到 miRNA 吸附柱中，13000rpm離心1分鐘，倒掉過(guò)濾液。
8．向吸附柱中加入700μl 75%異丙醇洗滌一次，13000rpm離心1分鐘，倒掉過(guò)濾液。
9．向吸附柱中加入500μl無(wú)水乙醇洗滌一次，13000rpm離心1分鐘，倒掉過(guò)濾液。
10．吸附柱 13000rpm 空離心2分鐘，去掉殘留的乙醇。
11．將吸附柱放入到新 1.5ml EP管中，室溫放置 2分鐘，使殘留乙醇揮發(fā)。在吸附柱濾芯上加入30μl RnaseFree TEBuffer，室溫靜置 2分鐘，13000rpm離心2分鐘，洗脫產(chǎn)物即為提取的miRNA。（通常取1～2μl該產(chǎn)物，即可使用我司一步法 miRNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，貨號(hào)：MT0006）。
二、細(xì)胞樣本提取
1．貼壁細(xì)胞：胰酶消化細(xì)胞后，離心收集細(xì)胞沉淀。用100μl的1×PBS 重懸細(xì)胞后，加入300μl miRNA Reagent A顛倒混合均勻，室溫放置 5分鐘。
2．懸浮細(xì)胞：直接離心后，收集細(xì)胞沉淀。用100μl 1×PBS重懸細(xì)胞后，加入300μl miRNA Reagent A顛倒混合均勻，室溫放置 5分鐘。
3．向上述裂解完畢的裂解液中加入250μl miRNA ReagentB，上下顛倒混合均勻。13000rpm離心5分鐘，吸取550μl上清液，轉(zhuǎn)移到新的1.5ml EP管中。
  注意：加入細(xì)胞體積數(shù)與miRNA Reagent B總體積數(shù)為350μl。如加入50μl細(xì)胞，則miRNA Reagent B使用300μl。
4．向上述550μl上清溶液中加入200μl無(wú)水乙醇，手腕用力震蕩數(shù)次，室溫放置 5分鐘。
5．13000rpm離心10分鐘，轉(zhuǎn)移700μl上清液到新的1.5ml EP管中。
6．向上述溶液中加入300μl 異丙醇，手腕用力上下顛倒數(shù)次。
7．分兩次將上述溶液倒入到 miRNA 吸附柱中，13000rpm離心1分鐘，倒掉過(guò)濾液。
8．向吸附柱中加入700μl 75%異丙醇洗滌一次，13000rpm離心1分鐘，倒掉過(guò)濾液。
9．向吸附柱中加入500μl無(wú)水乙醇洗滌一次，13000rpm離心1分鐘，倒掉過(guò)濾液。
10．吸附柱 13000rpm 空離心2分鐘，去掉殘留的乙醇。
11．將吸附柱放入到新 1.5ml EP管中，室溫放置 2分鐘，使殘留乙醇揮發(fā)。在吸附柱濾芯上加入30μl RnaseFree TEBuffer，室溫靜置 2分鐘，13000rpm離心2分鐘，洗脫產(chǎn)物即為提取的miRNA。（通常取1～2μl該產(chǎn)物，即可使用我司一步法 miRNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，貨號(hào)：MT0006）。


圖例：小鼠肌肉組織的小RNA提取
 A1-A2：TRIzol試劑
 B1-B2：A公司microRNA提取試劑
 C1-C2：我司miRNA提取試劑盒。

常見(jiàn)問(wèn)題：
1．本方法提取的小RNA，95％以上為小RNA（<200nt），有時(shí)會(huì)殘留一些>200nt的RNA，通常殘留的>200nt RNA不影響后續(xù)試驗(yàn)操作。
2．本試劑盒提取的小RNA由于不含mRNA等大分子量的RNA，因此更適合做后續(xù)反轉(zhuǎn)錄試驗(yàn)，從而進(jìn)行定量試驗(yàn)。
3．使用本試劑盒提取的miRNA濃度通常在50ng/μl左右，取5～10μl即可用于電泳檢測(cè)。取1～2μl即可用于我司TaqMan miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)（貨號(hào)：MT0006），并使用我司優(yōu)化的miRNA-TaqMan RealTime PCR技術(shù)（貨號(hào)：MTTxxxxx）。