microRNA熒光定量PCR試劑盒(SYBR Green熒光染料)采用特異性的上下游引物對反轉錄所得microRNA的cDNA產物進行定量檢測。不同于其它公司的單條特異性引物擴增方法，Biorab采用雙向特異性擴增引物（原理如圖1），從而極大提高了miRNA的檢測特異性，其可以區(qū)分極高相似度的miRNA分子、減少非特異性擴增（圖2，3所示）。該miRNA熒光定量PCR試劑盒對可以對任何miRNA分子進行檢測。miRNA熒光定量PCR試劑盒共有一萬余種，試劑盒編號為MTAXXXXX，每一個miRNA分子對應一個檢測試劑盒，可下載SYBR Green miRNA qPCR kit列表查詢。如果您研究的miRNA分子不在我們的列表中，請來信咨詢，我們將及時給您優(yōu)化設計。該試劑盒中的每一對引物均經過設計優(yōu)化，確保擴增效率和特異性。
產品組成：
2×Hi SYBR Green qPCR Mix
1ml
50×ROX Reference Dye
200μl
microRNA Primer F（10μM）
100μl
microRNA Primer R（10μM）
100μl
儲存：請置于-20℃，可保存2年；避免反復凍融。
操作方法：
1．按以下組分配制反轉錄反應液(反轉錄反應需購買我司的一步法microRNA反轉錄試劑盒)：
4×One step miRNA RT Solution
5μl
Rnase-Free H2O
Up to 20μl
2．在PCR 儀上按以下條件進行反應:
37℃——————60min
95℃——————5分鐘
3．獲得 cDNA 產物后使用microRNA 熒光定量 PCR 試劑盒進行 miRNA 定量檢測。根據(jù)機型選擇步驟A或B配制反應體系：
步驟A：需要添加 ROX 染料進行反應孔間信號矯正的Real-Time PCR 儀，包括：ABI PRISM 7900HT、7300、7500 Real-TimePCR（Applied Biosystems)；Mx3000P（Stratagene)等。按照如下組分配制 20μl PCR 反應體系：
2×Hi SYBR Green qPCR Mix
10μl
1×
50×ROX Reference Dye
0.4μl
1×
miRNA Primer F(10μM)
0.4μl
miRNA Primer R(10μM)
0.4μl
注：引物初次使用請用0.4μl，視實驗結果進行調整。
步驟B：無需添加 ROX 染料進行反應孔間信號矯正的RealTime PCR 儀，包括：LightCycler（Roche Diagnostics)；MiniOpticon、Opticon2、MyiQ 2、CFX96 Real-TimePCR(Bio-Rad & MJ)；Line-Gene(Bioer，杭州博日)等。按照如下組分配制 20μl PCR 反應體系：
2×Hi SYBR Green qPCR Mix
10μl
1×
miRNA Primer F(10μM)
0.4μl
miRNA Primer R(10μM)
0.4μl
注：引物初次使用請用0.4μl，視實驗結果進行調整。
4．進行 Real-Time PCR 反應，通常采用兩步法，程序如下：
注意：使用該方法通?？梢詼蚀_檢測到>0.01fM的microRNA 分子，過多的循環(huán)數(shù)會造成精確性降低。推薦的循環(huán)數(shù)為 30 個，在檢測極低樣品濃度時可將循環(huán)數(shù)調整到 35 個。
5．擴增結果分析和數(shù)據(jù)處理：
反應結束后確認 Real-Time PCR的cDNA 樣品和 NTC 陰性對照的擴增曲線和融解曲線。
6．標準品的使用
該試劑盒配備的標準品為單鏈 DNA 分子，其與目標microRNA 分子反轉錄產物完全相同，因此可直接用于 PCR擴增，從而檢測 PCR 體系的可靠性。其濃度為 1pM，通常20μl PCR 體系中加入1μl，可獲得 Ct 值在15 左右的數(shù)據(jù)。除此外，可以使用TE Buffer 進行稀釋，最低可稀釋到0.01fM，用于標準曲線擴增或絕對定量試驗。
常用內參miRNA熒光定量PCR試劑盒(染料法)
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