由于miRNA(microRNA)分子序列較小，僅20nt左右，沒有真核生物特有的Poly(A)尾巴結(jié)構(gòu)，采用傳統(tǒng)Oligo dT引物和隨機引物很難獲得從miRNA到cDNA的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。目前普遍采用的解決方案有兩種：特異性反轉(zhuǎn)錄引物（下圖A所示）、兩步加A法反轉(zhuǎn)錄方案（下圖B所示）。Biorab公司開發(fā)出一套全新的一步法miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒，可以對成熟的miRNA同時完成Poly(A)反應和反轉(zhuǎn)錄反應，直接獲得含有特異性tag和15(T)的cDNA產(chǎn)物（下圖C所示）。該方法使得miRNA反轉(zhuǎn)錄與mRNA的反轉(zhuǎn)錄一樣輕松,直接將提取的microRNA與反應緩沖液混合物混合并置于PCR儀上1小時即可獲得高濃度的、包含所有miRNA分子的cDNA產(chǎn)物,獲得的cDNA產(chǎn)物適合于采用SYBR Green染料法進行RealTime PCR進行定量檢測。
產(chǎn)品組成：
組分
MT0005A(25T)
MT0005B(100T)
4×One step miRNA RT Solution
125μl
500μl
10×miRNA RT Primer
50μl
200μl
儲存：請置于-20℃，可保存2年，避免反復凍融。
注：如4×One step miRNA RT Solution出現(xiàn)沉淀屬正?，F(xiàn)象，可用手捂化，混合均勻后使用不影響實驗結(jié)果。
特別說明： 10×miRNA RT Primer 引物為5'-CAGGTCCAGTTTTTTTTTTTTTTTVN-3'，定量擴增用特異性上下游引物進行擴增，下圖2是以 hsa-miR-21 為實例說明特異性上下游引物的設計方法（Biorab的microRNA 熒光定量 PCR 試劑盒提供所有 miRNA 檢測，貨號：MTAXXXXX，所有引物均經(jīng)過設計優(yōu)化，詳細請于引物列表中查詢。如果您研究的miRNA分子不在列表中，請來信咨詢，我們將及時給您優(yōu)化設計）。
圖1：技術(shù)原理圖：
圖2：hsa-miR-21實例設計原理：
操作方法：
1．按以下組分配制反轉(zhuǎn)錄反應液：
4×One step miRNA RT Solution
5μl
Rnase-Free H2O
Up to 20μl
2. 在PCR 儀上按以下條件進行反應：
37℃——————60min
95℃——————5分鐘
3．獲得 cDNA 產(chǎn)物后使用microRNA 熒光定量 PCR 試劑盒進行 miRNA 定量檢測。使用該試劑盒反轉(zhuǎn)錄所得 cDNA 產(chǎn)物包含了樣品中所有miRNA 反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，可用于多個基因的檢測分析，可使用內(nèi)參基因進行定量矯正。內(nèi)參基因可選擇使用RNU6B miRNA 熒光定量 PCR 試劑盒(貨號：MTA01501)，適用于來源于人和鼠等哺乳動物的樣品；RNU44 miRNA 熒光定量 PCR 試劑盒(貨號：MTA01502)、 RNU48 miRNA 熒光定量 PCR 試劑盒(貨號：MTA01503)，適用于來源于人的樣品；SnoRNA135 miRNA 熒光定量 PCR 試劑盒(貨號：MTA01504) 、SnoRNA202 miRNA 熒光定量 PCR 試劑盒(貨號：MTA01505)適用于來源于鼠的樣品。Biorab 提供的內(nèi)參擴增引物濃度均為 10μM，每 20μl 反應體系中加入0.4-0.8μl。
根據(jù)機型選擇步驟A或B，配制反應體系：
步驟A: 需要添加 ROX 染料進行反應孔間信號矯正的Real-Time PCR 儀，包括：ABI PRISM7000/7700/7900HT,7300/7500/7500 Fast Real-Time PCR（Applied Biosystems)；Mx3000P（Stratagene)等。按照如下組分配制 20μl PCR 反應體系：
5×Top HS SYBR Green qPCR Mix
4μl
1×
50×ROX Reference Dye
0.4μl
1×
PCR Forward Primer(10μM)
0.4-0.8μl
PCR Reverse Primer(10μM)
0.4-0.8μl
注：引物初次使用請用0.4μl，視實驗結(jié)果進行調(diào)整。
步驟B:無需添加 ROX 染料進行反應孔間信號矯正的Real-Time PCR 儀，包括：LightCycler（Roche Diagnostics)；MiniOpticon、Opticon2、MyiQ 2、CFX96 Real-Time PCR(Bio-Rad & MJ)；Line-Gene(Bioer，杭州博日)等。按照如下組分配制 20μl PCR 反應體系：
5×Top HS SYBR Green qPCR Mix
4μl
1×
PCR Forward Primer(10μM)
0.4-0.8μl
PCR Reverse Primer(10μM)
0.4-0.8μl
4．進行 Real-Time PCR 反應，通常采用兩步法，程序如下：
步驟
加入量
終濃度
循環(huán)數(shù)
Stage 3：
Dissociation analysis
注意：使用該方法通?？梢詼蚀_檢測到>0.01fM的microRNA 分子，過多的循環(huán)數(shù)會造成精確性降低。推薦的循環(huán)數(shù)為 30 個，在檢測極低樣品濃度時可將循環(huán)數(shù)調(diào)整到35 個。
5．擴增結(jié)果分析和數(shù)據(jù)處理：
反應結(jié)束后確認 Real-Time PCR的cDNA 樣品和 NTC 陰性對照的擴增曲線和融解曲線。
關鍵字： 一步法microRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒_microRNA_活體檢測_
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