品名：Smart-GST? GST Pull-Down Kit，貨號：IF9604，品牌：Engibody

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NIH、麻省理工、哈佛、斯坦福等世界名校課題組青睞并長期采購的GST Pull-Down試劑盒！

Smart-GST?蛋白互作GST Pull-Down試劑盒

Smart-GST? GST Pull-Down試劑盒的四大優(yōu)勢
 
1、本試劑盒適用于細胞蛋白體外互作、組織蛋白體外互作、純化重組蛋白體外互作以及這三類蛋白之間互作的研究。
 
2、本試劑盒用于驗證兩個已知蛋白的相互作用，也可以用于篩選與已知蛋白相互作用的未知蛋白。
 
3、本試劑盒完美銜接下游實驗（Western Blotting、MS質(zhì)譜）。
 
4、本實驗手冊是一本GST Pull-down實驗的全面技術(shù)手冊，透徹分析了GST Pull-down實驗中的重點、難點，對各種重點難點問題都有針對性的解決方案。同時包含了蛋白互作研究的基礎(chǔ)知識和經(jīng)典數(shù)據(jù)庫信息，有了這本保姆級使用手冊，所有疑難都會迎刃而解，GST Pull-down盡在掌握之中。



第一部分：背景簡介及應(yīng)用場景

GST pull down是將已知蛋白與GST融合，而該融合蛋白通過GST標簽與谷胱甘肽GSH磁珠親和結(jié)合。簡單來說，我們假定X蛋白和Y蛋白可能存在互作，將純化的融合GST的X蛋白和純化的Y蛋白以及能特異性結(jié)合GST的谷胱甘肽GSH磁珠混合在一起孵育一定時間，然后洗去未結(jié)合的蛋白，并洗脫誘餌蛋白X及獵物蛋白Y，隨后進行SDS-PAGE電泳。通過Western Blot檢測結(jié)果，可以看到GST-X蛋白和Y蛋白所對應(yīng)的條帶，即表明了X蛋白和Y蛋白因發(fā)生相互作用而被GST-X pull down。
 
備注：可以在下游銜接Western Blot、MS質(zhì)譜等實驗。其中Western Blot用于驗證已知的互作蛋白，MS質(zhì)譜用于篩選發(fā)現(xiàn)未知的互作蛋白。
 
1、GST Pull-down和CoIP，這兩種最經(jīng)典蛋白-蛋白互作技術(shù)的區(qū)別是什么？
1)、GST Pull-down———GST 標簽融合蛋白與獵物蛋白pull-down，In Vitro體外研究蛋白互作PPI的經(jīng)典方法。將目的蛋白序列加上GST或His標簽序列進行基因合成并構(gòu)建重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后表達純化蛋白，再將GST 標簽融合蛋白固定于GSH磁珠上作為誘餌蛋白，然后去拉取與之結(jié)合的獵物蛋白。
 
2)、CoIP———蛋白免疫共沉淀，In Vivo體內(nèi)研究蛋白互作PPI的經(jīng)典方法，保留在靶標細胞/組織內(nèi)的天然構(gòu)象蛋白互作的真實情況，可以用于驗證已知蛋白也可以用于篩選發(fā)現(xiàn)未知蛋白。
 
2、在下列兩種情況下GST Pull-down是不可替代和不可或缺的：
1)、誘餌蛋白找不到CoIP級的抗體，而GST Pull-down不需要CoIP級的免疫捕獲抗體，正好克服了這個難題。
 
2)、目的蛋白所在的研究對象（比如真菌等）無法采用普通的標簽質(zhì)粒轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)化的方法進行外源標簽融合蛋白的過表達，也找不到內(nèi)源蛋白的抗體，這時便無法實施CoIP實驗，因此GST Pull-down就是這類情況下研究蛋白互作的唯一選擇。
 
3、GST Pull-down的優(yōu)點
1)、鑒定的蛋白是直接作用的蛋白，而不是間接作用的多個獵物蛋白復合物；
2)、GST標簽蛋白可把一些難溶蛋白提高溶解度變成可溶性蛋白，使實驗變得具有可行性；
3)、GSH谷胱甘肽偶聯(lián)磁珠親和力強，洗脫純度高，且是非變性、溫和、競爭性洗脫。
 
4、GST Pull-down的缺點
1）、驗證互作是在離心管中進行的體外反應(yīng)，不能夠完全反映細胞內(nèi)蛋白真實互作的生理狀態(tài)；
2）、融合表達的GST標簽，肽鏈較長，大到26kD，可能會改變目的蛋白的天然構(gòu)象。
 
 
第二部分：技術(shù)原理和技術(shù)流程
技術(shù)原理：
 
基本原理是將靶蛋白與GST（Glutathione-S-transferase谷胱苷肽巰基轉(zhuǎn)移酶）的融合蛋白親和固化在谷胱甘肽（GSH）標記的磁珠上,作為與目的蛋白結(jié)合捕獲的支撐物,充當一種“誘餌蛋白”,目的蛋白溶液與之孵育,可從中捕獲與之相互作用的“獵物蛋白”(目的蛋白), 洗脫結(jié)合物后通過SDS-PAGE電泳，隨后可以進行下游的WB檢測或者質(zhì)譜分析, 從而證實兩種蛋白間的相互作用或篩選相應(yīng)的目的蛋白,“誘餌蛋白”和“獵物蛋白”均可來自于細胞裂解物、組織裂解物或純化的重組蛋白（重組蛋白可以通過大腸桿菌等表達系統(tǒng)或者體外轉(zhuǎn)錄翻譯系統(tǒng)獲得）。此方法簡單易行, 操作方便。
 
技術(shù)流程：
 


第四部分：實驗結(jié)果與示例展示
 
GST Pull down實驗僅僅是從樣本中捕獲富集特定目的蛋白的過程，必須銜接下游實驗才能得出有價值的結(jié)果。最常見的下游實驗是WB實驗：
 
Western blotting (WB，或稱為IB)
用于兩個已知蛋白互作驗證（In Vitro體外實驗）
 
 

第五部分：GST Pull Down試劑盒組分清單
（共計10個組分，均可單獨購買）
 

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