產(chǎn)品描述                                                                                
T7 High Yield Transcription Kit對(duì)體外轉(zhuǎn)錄體系進(jìn)行了優(yōu)化，能以帶有T7啟動(dòng)子的線(xiàn)性化質(zhì)粒、PCR產(chǎn)物或合成的DNA片段等為模板，在較短時(shí)間內(nèi)通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)獲得大量RNA，操作簡(jiǎn)單便捷。
本試劑盒轉(zhuǎn)錄合成的RNA可用于體外翻譯、顯微注射、RNA保護(hù)實(shí)驗(yàn)、探針雜交、RNAi和RNA結(jié)構(gòu)和功能研究等。試劑盒NTP是單獨(dú)提供，便于根據(jù)自己需求，在底物中加入修飾的核苷酸，制備生物素或染料標(biāo)記的RNA。
運(yùn)輸和保存
干冰運(yùn)輸，-20℃保存。
產(chǎn)品組分

產(chǎn)品用途
體外RNA合成
注意事項(xiàng)

1. 為了避免RNase污染，實(shí)驗(yàn)中請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服，戴一次性手套和口罩，使用RNase-Free耗材。

2. 實(shí)驗(yàn)所用DNA模板建議先純化，以避免RNase、蛋白及鹽離子殘留對(duì)反應(yīng)體系的影響。

3. Transcription Buffer (10×)中含有亞精胺，在低溫條件下會(huì)使DNA模板沉淀，需在室溫條件下配制反應(yīng)體系。

4. 如果需要合成標(biāo)記的RNA，請(qǐng)自備相應(yīng)的修飾NTP。如果需要合成加帽RNA，請(qǐng)自備帽結(jié)構(gòu)或帽類(lèi)似物。

模板制備
推薦使用以下幾種類(lèi)型的模板，模板可用TE緩沖液或RNase-free Water溶解。
1、質(zhì)粒模板
帶T7啟動(dòng)子的質(zhì)?？梢宰鳛檗D(zhuǎn)錄模板，質(zhì)粒的線(xiàn)性化程度和純度會(huì)影響轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)量及RNA的完整性。環(huán)狀質(zhì)粒由于沒(méi)有有效的終止，會(huì)轉(zhuǎn)錄出不同長(zhǎng)度的RNA產(chǎn)物，為了得到特定長(zhǎng)度的RNA，質(zhì)粒必須完全線(xiàn)性化，線(xiàn)性化的質(zhì)粒請(qǐng)確保雙鏈為平末端或5’端為突出結(jié)構(gòu)。
注：

1. RNase、鹽離子、蛋白等會(huì)對(duì)轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)生影響，為提高轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性，建議質(zhì)粒線(xiàn)性化后進(jìn)行純化，再作為模板使用。

2. 為確保轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物長(zhǎng)度與預(yù)期一致，建議質(zhì)粒酶切后切膠回收目的片段，以獲得高純度長(zhǎng)度單一的線(xiàn)性化模板。

2、PCR產(chǎn)物模板
帶T7啟動(dòng)子的PCR產(chǎn)物可以作為體外轉(zhuǎn)錄模板。PCR擴(kuò)增模板時(shí)將T7啟動(dòng)子（TAATACGACTCACTATAGGG）加在非編碼區(qū)的上游引物的5’端。PCR產(chǎn)物可直接作為模板，無(wú)需純化，但純化后可以獲得更高產(chǎn)量的RNA。
注：

1. 擴(kuò)增完需要通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳確定產(chǎn)物的特異性和產(chǎn)量。

2. 為了獲得更多的RNA，建議對(duì)PCR產(chǎn)物純化后作為模板。若電泳條帶單一，可以使用PCR產(chǎn)物回收試劑盒純化PCR產(chǎn)物后作為模板。若條帶不單一，建議對(duì)目的條帶切膠回收，回收產(chǎn)物作為模板。

3、合成的DNA模板
合成的帶有T7啟動(dòng)子的DNA片段也可以作為體外轉(zhuǎn)錄的模板。
實(shí)驗(yàn)流程

體外轉(zhuǎn)錄

1. 試劑解凍：將Transcription Buffer (10×)室溫下解凍和放置。將試劑盒其他組分振蕩混勻，短暫離心收集于管底，冰上儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/span>

2. 按下表比例配制反應(yīng)體系。

注：
a、Transcription Buffer (10 ×)中含有亞精胺，在低溫條件下會(huì)使DNA模板沉淀，因此，需在室溫條件下配制反應(yīng)體系。
b、若果進(jìn)行多個(gè)反應(yīng)，可以先混勻除模板和RNase Free Water以外的組分，分裝到各個(gè)管里，再加入模板。
c、反應(yīng)體系通常為20 μL，可以根據(jù)需要按比例放大或縮小體系。
d、對(duì)于長(zhǎng)模板（>1000 bp），建議使用線(xiàn)性化質(zhì)粒作為模板。
e、推薦每20 μL體系使用0.1-1 μg模板。

 3.混勻、離心、37℃反應(yīng)2-3 h。
注：建議使用PCR儀孵育，避免體系蒸發(fā)對(duì)實(shí)驗(yàn)造成影響。
 4.(選做）向反應(yīng)體系中加入1 μL Dnase I (1 U/μL)，37℃孵育15 min，消化DNA模板。
 5.合成的RNA經(jīng)電泳分析后純化，用RNase-free Water稀釋至合適濃度，可用于下游實(shí)驗(yàn)。
產(chǎn)物純化
1、酚/氯仿純化
a、加入160 μl RNase-free Water將產(chǎn)物稀釋至180 μl。
b、加入20 μl 3 M的醋酸鈉（pH 5.2）到稀釋后的產(chǎn)物中，用移液器充分混勻。
c、加入200 μl的酚/氯仿混合液（1：1）進(jìn)行抽提，室溫10000 rpm離心5 min，將上層溶液（水相）轉(zhuǎn)移至新的RNase-free EP管中。
d、加入與水相等體積的氯仿抽提2次，收集上層水相。
e、加入2倍體積的無(wú)水乙醇并混勻，-20℃孵育至少30 min，4℃ 15000 rpm離心15 min。
f、棄上清并加入500 μl預(yù)冷的70%乙醇洗滌RNA沉淀，4℃ 15000 rpm離心，棄上清。
g、開(kāi)蓋干燥2 min，加入20-50 μl RNase-free Water或其他緩沖液溶解RNA沉淀。
h、-80℃保存。
2、氯化鋰純化
a、20 μL體系中分別加入30 μL RNase Free Water和30 μL Lithium Chloride Precipitation Solution (7.5 M)，使Lithium Chloride的終濃度在2.5-2.8 mM之間。
b、-20℃放置至少30 min（可以放置過(guò)夜）。
c、12000 rpm離心15 min，去上清，收集沉淀。
d、用預(yù)冷的70%乙醇洗2次，每洗一次，離心5 min，倒棄液體，收集沉淀。
e、晾干RNA，RNase-free Water溶解后檢測(cè)。
3、柱純化
柱純化可以去除蛋白和游離核苷酸。
純化前加入80 μl RNase Free Water將產(chǎn)物稀釋至100 μl，再按柱純化說(shuō)明書(shū)進(jìn)行純化。
4、磁珠純化
磁珠純化可以去除蛋白和游離核苷酸。
按磁珠純化說(shuō)明書(shū)進(jìn)行純化。
RNA分析與定量
1、凝膠電泳分析：轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可以使用變性瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析，評(píng)估產(chǎn)物的長(zhǎng)度、完整性以及產(chǎn)量。
2、紫外吸收法進(jìn)行RNA定量：游離核苷酸會(huì)影響定量的準(zhǔn)確性，采用此方法前請(qǐng)先進(jìn)行RNA純化。
3、染料法進(jìn)行RNA定量：用RiboGreen染料進(jìn)行RNA定量，游離核苷酸不會(huì)影響定量，可以對(duì)純化或者未純化的反應(yīng)產(chǎn)物中的RNA進(jìn)行準(zhǔn)確定量。
常見(jiàn)問(wèn)題及解決方案1、轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物產(chǎn)量低 ①實(shí)驗(yàn)組模板中含有抑制反應(yīng)的成分
建議：重新對(duì)模板進(jìn)行純化，確定模板量及其完整性。
②實(shí)驗(yàn)?zāi)０逍蛄斜旧碓?/span>
建議：加大模板投入量；延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間；換用其他啟動(dòng)子和RNA聚合酶進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。2、短片段轉(zhuǎn)錄產(chǎn)量低 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物小于0.3 kb時(shí)，可以通過(guò)延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間（4 h-過(guò)夜反應(yīng)）或增加模板量來(lái)提高RNA產(chǎn)量。
3、RNA產(chǎn)物片段與預(yù)期不符
（1）RNA產(chǎn)物片段小于預(yù)期
①模板序列中包含類(lèi)似于T7 RNA聚合酶的終止序列。
建議：嘗試不同的RNA聚合酶。
②模板中GC含量高形成高級(jí)結(jié)構(gòu)。
建議：可以加入SSB蛋白，以提高轉(zhuǎn)錄效率，或者使用42℃進(jìn)行轉(zhuǎn)錄會(huì)提高轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的產(chǎn)量。
③RNase污染。
建議：實(shí)驗(yàn)過(guò)程中戴口罩、戴一次性手套并注意更換手套。使用一次性無(wú)酶槍頭、EP管。實(shí)驗(yàn)試劑使用前離心，避免試劑在瓶蓋或管口導(dǎo)致污染，開(kāi)蓋要小心，避免污染。（2）RNA產(chǎn)物片段大于預(yù)期 ①若是以線(xiàn)性化質(zhì)粒為模板，可能質(zhì)粒模板沒(méi)有完全線(xiàn)性化，或者有義鏈3'端為突出結(jié)構(gòu)。質(zhì)粒作為模板必須完全線(xiàn)性化，即使存在小量的未線(xiàn)性化模板，也可能產(chǎn)生大量的長(zhǎng)片段RNA產(chǎn)物。
建議：重新線(xiàn)性化質(zhì)粒，要確保線(xiàn)性化完全，并檢查模板結(jié)構(gòu)，確保有義鏈3'端不能是突出結(jié)構(gòu)。
②RNA存在未完全變性的二級(jí)結(jié)構(gòu)。
建議：使用變性膠來(lái)檢測(cè)RNA產(chǎn)物。
4、產(chǎn)物電泳拖尾現(xiàn)象
①轉(zhuǎn)錄及純化過(guò)程被RNase污染
建議：使用RNase-free的槍頭和EP管，實(shí)驗(yàn)中所用試劑都為RNase-free，戴一次性乳膠手套。
②電泳過(guò)程中被RNase污染
建議：電泳緩沖液用RNase-free Water配制，電泳槽和制膠器具用RNase-free Water浸泡，縮短電泳時(shí)間。
③DNA模板被RNase污染。
建議：重新純化模板DNA。


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