異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)是一種作用極強的誘導劑,不被細菌代謝而十分穩(wěn)定,因此被實驗室廣泛應用。IPTG常用于需要誘導β-半乳糖苷酶活性的克隆實驗。它常與X-Gal或Bluo-Gal結(jié)合使用,用于重組細菌菌落的藍白篩選,這些菌落可以誘導lac操縱子在大腸桿菌中的表達。IPTG與lacI阻遏蛋白結(jié)合并改變其構(gòu)象而發(fā)揮作用,防止β-半乳糖苷酶編碼基因lacZ的抑制。
1.能誘導酶的合成,但又不被分解的分子,稱為安慰誘導物。由于乳糖雖可誘導酶的合成,但又隨之分解,產(chǎn)生很多復雜的動力學問題,因此人們常用安慰誘導物來進行各種實驗。2.IPTG不被菌體代謝,為乳糖類似物,一旦進入細胞就會產(chǎn)生持續(xù)長久的誘導效果,所以IPTG的誘導效率高,往往只需要很少量(1mmol/L)即可達到理想誘導效果。由于IPTG不被代謝,在胞內(nèi)專一誘導外源蛋白的表達。不受細胞代謝的影響,誘導效果持續(xù)穩(wěn)定。乳糖有雙效作用,既能做為誘導劑異乳糖的前體物質(zhì),又可以做碳源,在誘導過程中,很不穩(wěn)定,IPTG因其優(yōu)異的穩(wěn)定性決定了它適合做實驗研究用。3.IPTG能在缺乏lacY基因下而有效地被抄送。4.半乳糖苷鍵中用硫代替了氧,失去了水解活性,但硫代半乳糖苷和同源的氧代化合物與酶位點的親和力相同,IPTG雖不為β–半乳糖苷酶所識別,但它是lac基因簇十分有效的誘導物。使用方法:首先把IPTG配制成23.83mg/ml(100mM)的水溶液,并進行過濾除菌后保存。然后在100ml的瓊脂培養(yǎng)基中,加入100μl的上述溶液、200μl的X-Gal(20mg/ml的二甲基甲酰胺(DMF)溶液)和100μl的Amp(100mg/ml),制作成IPTG、X-Gal、Amp平板培養(yǎng)基。當dna片段插入至pUC系列載體(或其他帶有l(wèi)acZ、Amp基因載體),然后轉(zhuǎn)化至lacZ缺失細胞中后,涂布上述的IPTG、X–Gal、Amp平板培養(yǎng)基,可根據(jù)長出菌體的藍白色,而方便地挑選出基因重組體(白色為具有DNA插入片段的基因重組體)。
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