果膠酶(pectinase)試劑盒說明書
分光光度法50管/24樣
注 意 :正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。
果膠酶(pectinase)試劑盒測定意義:
果膠酶(pectinase)是一類分解果膠質酶類的總稱,包括原果膠酶,果膠酯酶,多聚半乳糖醛酸酶和果膠裂解酶四大類,廣泛存在于植物果實和微生物中,主要用于食品、釀酒、環(huán)保、醫(yī)藥、紡織及日化用品行業(yè)。
測定原理:
果膠酶水解果膠生成半乳糖醛酸,具有還原性醛基,與DNS試劑反應生成紅棕色物質,在540nm有特征吸收峰,測定540nm處吸光值變化可計算得果膠酶活性。
自備實驗用品及儀器:
天平、低溫離心機、可見分光光度計、1 mL玻璃比色皿、恒溫水浴鍋。
試劑組成和配制:
提取液:液體50mL×1瓶,4℃保存。
試劑一:液體30mL×1瓶,4℃保存。
試劑二:粉劑×2瓶,4℃保存;臨用前加入12.5mL試劑一,50℃加熱溶解,用不完的試劑4℃保存一周。
試劑三:液體30mL×1瓶,4℃避光保存。
酶液提取:
1.組織:按照組織質量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液),進行冰浴勻漿。10000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。
2.細菌、真菌:按照細胞數(shù)量(104個):提取液體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬細胞加入1mL提取液),冰浴超聲波破碎細胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時間3min);然后10000g,4℃離心10min,取上清置于冰上待測。
3. 細胞培養(yǎng)液等:直接檢測。
果膠酶(pectinase)試劑盒測定操作表:
| 對照管 | 測定管 |
試劑二(μL) | 400 | 400 |
50℃水浴溫育5min |
樣本(μL) |
| 100 |
煮沸樣本(μL) | 100 |
|
混勻,50℃水浴反應30min |
試劑三(μL) | 500 | 500 |
沸水浴5min,冰浴冷卻終止反應,8000g,4℃,離心10min,取上清,蒸餾水調(diào)零,1mL玻璃比色皿測定540nm處吸光值A,△A=A測定管-A對照管。每個測定管需設一個對照管。 |
酶活性計算公式:
標準曲線:y = 3.9642x - 0.008;R2 = 0.9996;x為標準品濃度,mg/mL;y為吸光值。
1.按照蛋白濃度計算
酶活性定義:在50℃,pH3.5條件下,每毫克蛋白每小時分解果膠產(chǎn)生1mg半乳糖醛酸為一個酶活力單位。
果膠酶活性(mg/h/mg prot)= (ΔA+0.008) ÷3.9642×V反總÷(V樣×Cpr)÷T
= 2.523×(ΔA+0.008)÷Cpr
2.按照樣本質量計算
酶活性定義:在50℃,pH3.5條件下,每克樣本每小時分解果膠產(chǎn)生1mg半乳糖醛酸為一個酶活力單位。
果膠酶活性(mg/h /g 鮮重)=(ΔA+0.008) ÷3.9642×V反總÷(V樣×W÷V樣總)÷T
= 2.523×(ΔA+0.008)÷W
3. 按細胞數(shù)量計算
酶活性定義:在50℃,pH3.5條件下,每104細胞每小時分解果膠產(chǎn)生1mg半乳糖醛酸為一個酶活力單位。
果膠酶活性(mg/h /104cell)=(ΔA+0.008) ÷3.9642×V反總÷(V樣×細胞數(shù)量÷V樣總)÷T
= 2.523×(ΔA+0.008)÷細胞數(shù)量
4.細胞培養(yǎng)液
果膠酶(pectinase)試劑盒酶活性定義:在50℃,pH3.5條件下,每毫升培養(yǎng)液每小時分解果膠產(chǎn)生1mg半乳糖醛酸為一個酶活力單位。
果膠酶活性(mg/h /mL)=(ΔA+0.008) ÷3.9642×V反總÷V樣÷T=2.523×(ΔA+0.008)
V反總:反應總體積,0.5mL;V樣:反應中樣本體積,0.1mL;V樣總:加入提取液體積,1mL;Cpr:樣本蛋白濃度,mg/mL;W,樣本質量,g;T:反應時間,0.5h
注意事項:
1. 試劑二若有沉淀析出,請置于50℃加熱溶解。
2. 測定之前請先做預實驗,如果吸光值較高或較低,請用提取液做適當?shù)南♂尰蛘呒哟髽颖玖浚⒃谟嬎愎街谐艘韵♂尡稊?shù)或者以實際加入的樣本體積參與計算。
3. 煮沸樣本建議在沸水中煮沸10分鐘,以將酶徹底滅活。
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