谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT）活性測定試劑盒說明書
分光光度法50管/24樣
注 意 ：正式測定前務(wù)必取2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定
谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT）活性測定試劑盒測定意義：
GPT（EC 2.6.1.2）廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細胞中，催化氨基酸和酮酸轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)，在氨基酸代謝中具有重要作用。此外，哺乳動物肝細胞GPT活性很高，當肝細胞壞死，GPT釋放到血液中，血清GPT活性顯著增高。因此，GPT被世界衛(wèi)生組織推薦為肝功能損害最敏感的檢測指標。
測定原理：
GPT催化丙氨酸和α-酮戊二酸發(fā)生轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)，生成丙酮酸和谷氨酸；加入2,4-二硝基苯肼溶液，不僅終止上述反應(yīng)，而且與酮酸中的羰基加成，生成丙酮酸苯腙；苯腙在堿性條件下呈紅棕色，可以在505nm讀取吸光值并計算酶活力。
試驗中所需的儀器和用品：
可見分光光度計、水浴鍋、臺式離心機、可調(diào)式移液器、1 mL玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。
試劑的組成和配制：
提取液：30mL×1瓶，4℃保存。
試劑一：液體5 mL×1瓶， 4℃保存；
試劑二：液體5 mL×1瓶， 4℃保存；
試劑三：液體50 mL×1瓶，4℃保存；
谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT）活性測定試劑盒樣品測定的準備：
1、細菌、細胞或組織樣品的制備：
細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細菌或細胞數(shù)量（104個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細菌或細胞加入1mL提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。
組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。
2、血清（漿）樣品：直接檢測。
測定操作表：
1、 分光光度計預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至505nm，蒸餾水調(diào)零。
2、 在EP管中加入下列試劑
試劑名稱（μL） | 測定管 | 對照管 |
待測樣本 | 20 |
|
煮沸10min的待測樣本 |
| 20 |
試劑一 | 100 |
|
蒸餾水 |
| 100 |
混勻后，37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）準確反應(yīng)20min
混勻后，37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）準確水浴20min
混勻，室溫放置10min，在505nm波長處，測各管吸光度A。ΔA=A測定管-A對照管。每個測定管需設(shè)一個對照管。
谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT）活性測定試劑盒計算：
1、標準條件下測定的回歸曲線， y = 0.4228x+0.0003 (x為標準品濃度，umol/mL；y為ΔA)。
2、血清（漿）GPT活力的計算
單位的定義：每mL血清（漿）每分鐘催化產(chǎn)生1nmol丙酮酸定義為一個酶活力單位。
GPT（nmol/min/mL）=（ΔA-0.0003）÷0.4228÷T×103=118.26×（ΔA-0.0003）
3、細胞、細菌和組織中GPT活力的計算
（1）按樣本蛋白濃度計算：
單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol丙酮酸定義為一個酶活力單位。
GPT（nmol/min/mg prot）=[（ΔA-0.0003）÷0.4228×V1]÷(V1×Cpr)÷T×103 =118.26×（ΔA-0.0003）÷Cpr
需要另外測定，建議使用本公司BCA蛋白質(zhì)含量測定試劑盒。
（2） 按樣本鮮重計算：
單位的定義：每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1nmol丙酮酸定義為一個酶活力單位。
GPT（nmol/min/g鮮重）=[（ΔA-0.0003）÷0.4228×V1]÷(W×V1÷V2)÷T×103 =118.26×（ΔA-0.0003）÷W
（3）按細菌或細胞密度計算：
單位的定義：每1萬個細菌或細胞每分鐘催化產(chǎn)生1nmol丙酮酸定義為一個酶活力單位。
GPT（nmol/min/104 cell）=[（ΔA-0.0003）÷0.4228×V1]÷(500×V1÷V2)÷T×103 =0.236×（ΔA-0.0003）
V1：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.02mL；V2：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時間，20min；Cpr：蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細胞或細菌總數(shù)，500萬；103：1umol/mL=103 nmol/mL。
1、 標準曲線線性范圍為：0.01 umol/mL -2 umol/mL。
2、 ΔA線性范圍為：0.01 -2。
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