醛基活化瓊脂糖基質(zhì)在制備和使用定制親和層析填料方面具有良好的記錄。將生物特異性配體與醛基活化瓊脂糖偶聯(lián)是一項(xiàng)成功且有據(jù)可查的技術(shù)。

醛基活化瓊脂糖層析填料(Aldehyde-activated SepFast)通過還原胺化反應(yīng)與含有伯胺基團(tuán)的配體形成化學(xué)穩(wěn)定的仲胺鍵。這種預(yù)活化的瓊脂糖基質(zhì)可用于親和層析填料的定制，適用于小規(guī)模和大規(guī)模純化應(yīng)用。

1. 屬性

有2種基質(zhì)可供選擇，適合各種待偶聯(lián)或純化的分子。

• 醛基活化瓊脂糖層析填料(Aldehyde-activated SepFast 4 High Flow)由高度交聯(lián)的4%珠狀瓊脂糖組成。其大孔徑適用于偶聯(lián)或純化大分子。它具有高機(jī)械剛度，可在降低背壓的情況下實(shí)現(xiàn)高流量。

• 醛基活化瓊脂糖層析填料(Aldehyde-activated SepFast 6 High Flow)由高度交聯(lián)的6%珠狀瓊脂糖組成。其適中的孔徑適用于偶聯(lián)較小的分子。它也具有高機(jī)械剛度，可在降低背壓的情況下實(shí)現(xiàn)高流量。

由于瓊脂糖具有出色的親水性和低非特異性結(jié)合特性，長(zhǎng)期以來(lái)一直用于色譜分離。這些顆粒具有開孔結(jié)構(gòu)，對(duì)各種分子具有出色的傳質(zhì)性能?；|(zhì)通過氧化被激活以產(chǎn)生醛基，它直接與分子中的伯胺基反應(yīng)，在還原劑存在的情況下被固定化。

醛基活化瓊脂糖層析填料(Aldehyde-activated SepFast)以20%乙醇中的水懸浮液形式提供。

表1  醛基活化瓊脂糖層析填料(Aldehyde-activated SepFast)的特性

2. 配體固定化

以下是一般的配體偶聯(lián)程序。

2.1  將目標(biāo)配體溶解在偶聯(lián)緩沖液中，0.1 M磷酸鈉，pH 7.0。一般對(duì)于蛋白質(zhì)配體，凝膠的制備濃度為5 - 20 mg/ml。對(duì)于小配體，凝膠的制備濃度為10 - 100  µmol/ml。偶聯(lián)緩沖液的體積可以是固定凝膠體積的一半或相同。

2.2  在過濾裝置中用至少5 倍體積的偶聯(lián)緩沖液清洗醛活化凝膠。

2.3  將洗凈并吸干的凝膠（來(lái)自步驟  2.2）轉(zhuǎn)移到步驟  2.1 制備的溶液中。

如果發(fā)生變化，請(qǐng)調(diào)整 pH 值。

2.4  將漿液在通風(fēng)良好的通風(fēng)櫥中在室溫下混合 2?4 小時(shí)。

2.5  將氰基硼氫化鈉（0.5 g/100 ml  活性凝膠）加入漿液中，過夜。注意：氰基硼氫化鈉有毒，應(yīng)格外小心處理。

2.6  用至少 5 倍凝膠體積的偶聯(lián)緩沖液清洗凝膠。

2.7 在氰基硼氫化鈉存在下，將凝膠重新懸浮到相同體積的封閉溶液，0.1 M Tris/HCl，pH 8.0或1 M乙醇胺，pH 8.0中2-3小時(shí)。

2.8 用5倍體積的0.1 M Tris/HCl + 1 M NaCl，pH 8.0 洗滌凝膠，然后用5倍體積的0.1 M醋酸鹽緩沖液 + 1 M NaCl，pH 4.0洗滌凝膠。

2.9 使用前用工作/平衡緩沖液清洗凝膠。

3. 固定化效率的一般考慮

3.1 pH

還原胺化可以在pH 4 - 10之間非常有效地進(jìn)行。但是可以優(yōu)化偶聯(lián)pH以獲得結(jié)果（例如，高偶聯(lián)產(chǎn)率和高配體活性）。

在配體溶解后要注意調(diào)整偶聯(lián) pH 值。

3.2 偶聯(lián)方案

應(yīng)避免使用含有氨基的溶液。

可以引入稀釋的某些有機(jī)溶劑以提高配體的溶解度。應(yīng)事先測(cè)試此類溶劑的適用性。

耦合溶液的體積與活化凝膠的體積保持一致。建議使用0.5-1 : 1 v/v的理想比例。

3.3 鹽

偶聯(lián)緩沖液中鹽的存在（例如0.5  M 或飽和）可以提高固定效率。

3.4 基礎(chǔ)基質(zhì)中的活化基團(tuán)

對(duì)于某些配體或應(yīng)用，基礎(chǔ)基質(zhì)中的活化水平可能過高，偶聯(lián)配體的活性可能會(huì)降低。

在降低的 pH 值下偶聯(lián)可能會(huì)減少配體分子的連接點(diǎn)。它可以提高偶聯(lián)配體的活性。活化基團(tuán)的受控封閉，例如在添加配體前幾個(gè)小時(shí)用  5?10  mM  封閉緩沖液孵育凝膠，也可以減少過度偶聯(lián)問題。

3.5 反應(yīng)時(shí)間

可以優(yōu)化偶聯(lián)過程中配體和活化填料之間的接觸時(shí)間以保持配體的生物活性。

3.6 還原劑的選擇

其他還原劑如硼氫化鈉可用于偶聯(lián)反應(yīng)。氰基硼氫化物是一種較溫和的還原劑，它只還原醛基和伯胺基之間形成的中間席夫堿，得到穩(wěn)定的仲胺鍵。硼氫化物是一種更強(qiáng)的還原劑，可還原席夫堿和未偶聯(lián)的醛基。

3.7 屏蔽剩余的活化配體

未與配體反應(yīng)的活化基團(tuán)應(yīng)通過添加含有pH 8 - 9伯胺的額外小分子（例如 Tris 或乙醇胺）來(lái)封端。

3.8 最終填料的洗滌

偶聯(lián)反應(yīng)后需要將未連接或弱連接的配體完全洗掉。采用高pH值和低pH值交替的洗滌方法可以確保有效去除不需要的物質(zhì)。

4. 固定化親和填料的使用

配體偶聯(lián)填料可用于使用間歇攪拌罐模式或填充柱模式的純化。處理這種材料遵循與處理其他基于瓊脂糖基質(zhì)相同的原則。

5. 儲(chǔ)存

醛基活化瓊脂糖層析填料(Aldehyde-activated SepFast)t應(yīng)在8℃下儲(chǔ)存。偶聯(lián)的濕填料應(yīng)在防菌劑（例如20%乙醇）存在的情況下于4-8℃儲(chǔ)存。切勿凍存耦合填料。

6. 更多信息

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