羧基活化的瓊脂糖可用于固定含胺分子。耦合化學(xué)是基于碳二亞胺的，是一項(xiàng)成功且有據(jù)可查的技術(shù)。
羧基活化瓊脂糖層析填料(Carboxyl-activated SepFast)與含有伯胺基團(tuán)的配體形成化學(xué)穩(wěn)定的酰胺鍵，它有一個(gè)長間隔區(qū)（9個(gè)原子）。預(yù)活化的瓊脂糖基質(zhì)可以用于制作各種定制的親和層析填料，適用于小規(guī)模和大規(guī)模純化應(yīng)用。
- 屬性
羧基活化瓊脂糖層析填料(Carboxyl-activated SepFast 4HF)由高度交聯(lián)的4%珠狀瓊脂糖制成。它具有高機(jī)械剛度，可在降低背壓的情況下實(shí)現(xiàn)高流量。
由于瓊脂糖具有出色的親水性和低非特異性結(jié)合特性，長期以來一直用于色譜分離。這些顆粒具有開孔結(jié)構(gòu)，對大蛋白質(zhì)分子具有出色的傳質(zhì)性能。
通過將長的親水性間隔臂連接到骨架上來活化基礎(chǔ)基質(zhì)。它直接與分子中的伯胺基反應(yīng)，在碳二亞胺試劑存在下被固定。羧基活化瓊脂糖層析填料(Carboxyl-activated SepFast)以20%乙醇中的水懸浮液形式提供。
表1 羧基活化瓊脂糖層析填料(Carboxyl-activated SepFast 4HF)的特性
- 配體固定化
以下是配體一般的偶聯(lián)流程。
2.1 將目標(biāo)配體溶解在偶聯(lián)緩沖液中，將pH值調(diào)整為4.5。偶聯(lián)緩沖液的體積可以是固定凝膠體積的一半或相同。
2.2 在過濾裝置中用至少5 倍體積的偶聯(lián)緩沖液清洗羧基活化凝膠。
2.3 將洗凈并吸干的凝膠（來自步驟 2.2）轉(zhuǎn)移到步驟2.1 制備的溶液中。
2.4 將碳二亞胺作為干粉或預(yù)先溶解的溶液添加到漿液中，最終濃度為0.1 M。如果碳二亞胺預(yù)先溶解在水中，則將pH值調(diào)整為4.5。
2.5 在室溫或4-8℃下混合漿料。
2.6 在第1個(gè)小時(shí)內(nèi)通過添加 0.1 M NaOH調(diào)節(jié)反應(yīng)pH值至4.5。
2.7 將偶聯(lián)反應(yīng)放置2-24小時(shí)。
2.8 用5倍體積的0.1 M 醋酸鹽緩沖液 + 0.5 M NaCl，pH 4.0洗滌凝膠，然后用5倍體積的0.1 M Tris/HCl + 0.5 M NaCl，pH 8.0洗滌凝膠。重復(fù)上述洗滌2次以上。
2.9 使用前用工作/平衡緩沖液清洗凝膠。
- 固定化效率的一般考慮
3.1 pH
偶聯(lián)反應(yīng)在pH 4.5 - 7.5之間非常有效地進(jìn)行。但是可以優(yōu)化偶聯(lián)pH以獲得結(jié)果（例如，高偶聯(lián)產(chǎn)率和高配體活性）。
在偶聯(lián)反應(yīng)的第1個(gè)小時(shí)內(nèi)，pH值會(huì)降低。要記得通過添加0.1 M NaOH來調(diào)節(jié)偶聯(lián)pH值。之后pH值會(huì)趨于穩(wěn)定。
3.2 偶聯(lián)方案
去離子水可直接用作偶聯(lián)溶液。應(yīng)避免使用含有氨基、巰基或羧基的緩沖溶液，因?yàn)樗鼈儠?huì)與配體偶聯(lián)發(fā)生競爭。
可以引入稀釋的某些有機(jī)溶劑以提高配體的溶解度。應(yīng)事先測試此類溶劑的適用性。
3.3 碳二亞胺的選擇
應(yīng)使用水溶性碳二亞胺，例如1?乙基?3?(3?二甲基氨基丙基)碳二亞胺 (EDC) 或1?環(huán)己基?3?(2?嗎啉代乙基) 碳二亞胺 (CMC)（通常合成為 metho?p?甲苯磺酸鹽）。EDC是最常用的碳二亞胺試劑。
3.4 碳二亞胺的濃度
添加的碳二亞胺的量應(yīng)以化學(xué)計(jì)量的方式超過活化的羧基。建議以最終反應(yīng)漿料中的0.1 M作為起點(diǎn)。
3.5 反應(yīng)時(shí)間和溫度
可以優(yōu)化偶聯(lián)過程中配體和活化填料之間的接觸時(shí)間以保持配體的生物活性。
典型的反應(yīng)時(shí)間是在室溫或冷藏室中過夜。
3.6 屏蔽剩余的活化配體
如果加入過量的配體，則可能不需要封閉殘留的活化基團(tuán)。
未與配體反應(yīng)的活化基團(tuán)應(yīng)在碳二亞胺存在下通過添加額外的含有pH 8 - 9伯胺的小分子（例如1 M乙醇胺）來封端。
3.7 最終填料的洗滌
偶聯(lián)反應(yīng)后需要將未連接或弱連接的配體完全洗掉。采用高pH值和低pH值交替的洗滌方法可以確保有效去除不需要的物質(zhì)。
- 固定化親和填料的使用
配體偶聯(lián)填料可用于使用間歇攪拌罐模式或填充柱模式的純化。處理這種材料遵循與處理其他基于瓊脂糖基質(zhì)相同的原則。
- 儲(chǔ)存
羧基活化瓊脂糖層析填料(Carboxyl-activated SepFast)應(yīng)在8℃下儲(chǔ)存。偶聯(lián)的濕填料應(yīng)在防菌劑（例如20%乙醇）存在的情況下于4-8℃儲(chǔ)存。切勿凍存耦合填料。
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