凝血酶，一種使纖維蛋白原水解成為纖維蛋白的蛋白酶，由308個氨基酸殘基組成，且是雙鏈分子，含有A鏈和B鏈，兩鏈間由二硫鍵連接，其中，A鏈含49個氨基酸殘基，又稱輕鏈，B鏈由259個氨基酸殘基組成，又稱重鏈；本品存在于動物血液中，通常以無活性的酶原形式存在，能直接作用于凝血過程的最后環(huán)節(jié)，使纖維蛋白原變成纖維蛋白，加速血液凝固，起到快速止血的作用；能激活凝血因子Ⅷ，使可溶性纖維蛋白轉(zhuǎn)變?yōu)殡y溶性纖維蛋白而形成凝血塊，達(dá)到止血目的；可增強(qiáng)凝血因子Ⅷ和Ⅴ的活性，在鈣和磷脂的參與下，促進(jìn)凝血酶因子Xa，使凝血酶原轉(zhuǎn)變?yōu)槟福荒艽龠M(jìn)血小板發(fā)生不可逆性的聚集和血小板釋放反應(yīng)，加速血液凝固；還可促進(jìn)上皮細(xì)胞的有絲分裂，使創(chuàng)傷愈合時間縮短30%～50%；因此，常用于結(jié)扎止血困難的小血管、毛細(xì)血管以及實質(zhì)性臟器出血的止血，也可用于外傷、手術(shù)、口腔科、耳鼻喉科、泌尿科、婦產(chǎn)科以及消化道等部位的出血。白色類白色的凍干塊狀或粉末，易溶于水，不溶于有機(jī)溶劑。由308個氨基酸殘基組成的蛋白它是雙鏈分子，含有A鏈和B鏈，兩鏈間由二硫鍵連接。A鏈含49個氨基酸殘基，又稱輕鏈; B鏈由259個氨基酸殘基組成，又稱重鏈。A鏈氨基末端氨基酸是蘇氨酸(Thr);而 B鏈氨基末端氨基酸是異亮氨酸 (Ile), 其最初的 4個氨基酸殘基是異亮氨酸-頡氨酸-谷氨酸-甘氨酸(Ile-Val-Glu-Gly。凝血酶在體內(nèi)以凝血酶原形式存在, 在凝血過程中, 凝血酶原復(fù)合物將其激活而轉(zhuǎn)變?yōu)橛薪z氨酸蛋白類水解活性的凝血酶。 凝血酶的形成在凝血過程中起到了中心作用。 凝血酶形成后的作用至少包括以下5個方面：
(1)啟動：一旦凝血酶形成后, 便可迅速啟動以后階段的止凝血過程, 包括作為促凝劑激活血小板、內(nèi)皮細(xì)胞, 并激活因子 V、Ⅶ 、Ⅷ 。
(2)放大；凝血反應(yīng)的放大是通過促凝酶復(fù)合物在內(nèi)皮下基質(zhì)和周圍血細(xì)胞表面合成而實現(xiàn)的。 其中, 凝血反應(yīng)的放大主要是通過 α-凝血酶的激活來完成, 同時, 凝血的放大反應(yīng)相又可促使生成更多的 α-凝血酶, 并在血管受損傷處形成穩(wěn)定的血栓, 從而終止血液丟失。
(3)血塊形成的終止：血塊形成的終止至少涉及兩個連續(xù)的抑制過程和一個動力學(xué)抑制過程。 前者主要是蛋白酶抑制劑 AT-Ⅲ 系統(tǒng)和組織因子途徑抑制物(TFPI)系統(tǒng) 。 而動力學(xué)抑制系統(tǒng)則是通過蛋白 C途徑進(jìn)行的。 在蛋白 C途徑中, 首先是 APC的生成, 而 APC的形成則是通過 α-凝血酶與血栓調(diào)節(jié)蛋白(thrombomodulin, TM)所形成的復(fù)合物, 即 α-凝血酶-TM使 PC變?yōu)?APC。通過這一動力學(xué)抑制系統(tǒng)可滅活凝血酶原酶和內(nèi)源性凝血酶成分, 主要是輔因子蛋白如因子 Va和Ⅷ a的活性, 從而參與終止血塊的形成。
(4)血塊的清除：血塊的清除是組織修復(fù)過程中的基本步驟, 同時要求纖溶酶的參與。 凝血酶對這一過程的調(diào)控是通過影響纖溶而間接對其產(chǎn)生影響的。 通過 TM-α-凝血酶復(fù)合物產(chǎn)生的 TAFIa可降低由 tPA及纖維蛋白激活谷氨酸纖溶酶原的速率, 保護(hù)纖維蛋白免受降解。 在 APC存在時, α-凝血酶的生存可顯著減少, 同時降低 TAFIa的激活。
(5)修復(fù)：對損傷組織的修復(fù)是凝血過程的最后一步。 這一過程需要纖溶酶激活金屬蛋白酶, 后者可使受損的細(xì)胞外基質(zhì)降解, 并促使新生細(xì)胞遷移至受損傷部位。 在這一過程中, 凝血酶是一種強(qiáng)有力的生長因子和趨化吸引劑, 其對成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞有激活效應(yīng);α-凝血酶可激活血小板, 使血小板釋放血管活性物和生長因子, 促進(jìn)不同類型的細(xì)胞增殖和生長。

圖1為凝血酶凍干粉1.粗凝血酶的分離
粗凝血酶的提取即去除血漿中的纖維蛋白原等雜蛋白, 同時保留凝血因子, 有利于凝血酶原的激活。 凝血酶原本身沒有活性, 不能將纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為纖維蛋白, 只有將其激活成凝血酶后才能在凝血級聯(lián)反應(yīng)中發(fā)揮作用。
(1)凝血酶原的提?。耗冈奶崛⊥ǔ２捎?3種方法:等電點沉淀法、檸檬酸鋇吸附法和氫氧化鎂吸附法。
等電點沉淀法根據(jù)蛋白質(zhì)在溶液 pH為其等電點的條件下溶解度最低的原理, 用 1%的醋酸將適當(dāng)稀釋后的血漿 pH調(diào)至凝血酶的等電點 5.0～ 5.5之間, 靜置分層后離心, 緩沖液溶解沉淀后即得粗凝血酶原溶液。
檸檬酸鋇吸附法則根據(jù)檸檬酸鋇能吸附依賴于維生素 K的凝血因子這一特性, 在檸檬酸鈉抗凝獲得的血漿中加入氯化鋇產(chǎn)生檸檬酸鋇, 凝血酶原等因子隨之沉淀分離出來, 沉淀用EDTA解吸, 再離心去沉淀后獲得粗凝血酶原溶液。
氫氧化鎂吸附法由 Seeger首次報道, 以等電點沉淀法為基礎(chǔ), 沉淀用氫氧化鎂吸附溶解的沉淀物, 以二氧化碳洗脫凝血酶原, 再加硫酸銨至 65%飽和度沉淀凝血酶原。
以上 3種方法相比, 等電點沉淀法操作較簡便, 應(yīng)用較多,但得到的粗凝血酶活性不高;后兩種方法得到的粗凝血酶活性較前者有所提高, 但操作比較繁瑣。
(2)凝血酶原激活：生理條件下 , 凝血酶由凝血酶原在凝血因子Ⅹa、凝血因子 V、Ca2+和磷脂作用下激活生成。 在缺乏某些激活因子的情況下, 也能將凝血酶原轉(zhuǎn)化為凝血酶, 但是轉(zhuǎn)化率很低。 在從血漿中提取凝血酶的過程中, 凝血酶原的激活是關(guān)鍵的一步。采用單獨的Ca2+激活, 即在粗凝血酶原溶液中加入一定濃度的 CaCl2溶液, 室溫下放置 1.5～2 h, 凝血酶活性達(dá)到最高, 殘留的纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為纖維蛋白后析出 , 過濾后即得活化的粗凝血酶溶液。
2.粗凝血酶的純化
純化的方法有很多種, 傳統(tǒng)的物理化學(xué)方法即丙酮沉淀法和硫酸銨分級鹽析法, 這兩種方法操作簡便, 成本低, 但得到的凝血酶制品純度不高, 回收率低, 應(yīng)用上受到一定限制。 與傳統(tǒng)的物理化學(xué)方法相比, 采用層析法分離血漿蛋白具有高特異性、高選擇性的優(yōu)點, 能夠用于血漿中一些微量物質(zhì)的分離, 以獲得高純度的適合臨床需要的血漿制品 , 并且與沉淀法相比更易于自動化;同時, 層析法純化過程中還能起到去除血漿制品中的病原體的作用, 從而提高血液制品臨床使用的安全性。目前純化凝血酶的層析法主要采用凝膠過濾層析、離子交換層析和肝素親和層析三種方法。
(1)凝膠過濾層析：凝膠過濾層析是應(yīng)用凝膠過濾介質(zhì)分離不同大小的物質(zhì)的一種技術(shù), 可用于相對分子質(zhì)量從幾百到10︿6數(shù)量級的物質(zhì)的分離純化。 該技術(shù)常用于蛋白質(zhì)等生物大分子的分級分離和除鹽。 凝血酶的分子質(zhì)量為 36 ku, 選擇適的過濾介質(zhì)就能有效的去除其他雜蛋白。
(2)離子交換層析：離子交換層析是利用蛋白質(zhì)所帶離子或表面電荷的區(qū)別, 將目標(biāo)蛋白吸附到 DEAE、CM等離子交換柱上而達(dá)到去除雜蛋白的目的的一種方法。 離子交換層析在治療用血漿蛋白制品的制備中得到廣泛的應(yīng)用。 在 pH﹥ 5.5的條件下, 凝血酶分子帶負(fù)電荷, 因此可用陰離子交換柱對其進(jìn)行純化。
(3)肝素親和層析：親和層析是應(yīng)用耦聯(lián)親和配基的親和吸附介質(zhì)為固定相親和吸附目標(biāo)產(chǎn)物, 使目標(biāo)產(chǎn)物得到分離純化的液相層析法。 凝血酶與低分子質(zhì)量肝素之間有特異性的作用。 利用它們之間的特異性親和作用, 可以將低分子質(zhì)量肝素固定載體上, 對凝血酶進(jìn)行親和層析純化。1.本品遇酸、堿、重金屬發(fā)生反應(yīng)而降效。
2.為提高上消化道出血的止血效果，宜先服一定量制酸劑中和胃酸后口服本品，或同時靜脈給予抑酸劑。
3.本品還可用磷酸鹽緩沖液(pH7.6)或冷牛奶溶解。如用阿拉伯膠、明膠、果糖膠、蜂蜜等配制成乳膠狀溶液，可提高凝血酶的止血效果，并可適當(dāng)減少本品用量。
有關(guān)凝血酶的概述、理化性質(zhì)、藥理作用、臨床應(yīng)用、注意事項等是由Chemicalbook的丁紅編輯整理。（2015-11-16）1.對于發(fā)生急性消化道出血的患者可口服凝血酶使出血部位迅速止血。
2.對難治性產(chǎn)后出血可采用液體噴灑或紗布按壓的方式給予凝血酶止血治療。
3.在泌尿外科中可通過導(dǎo)尿管灌注凝血酶溶液和抗生素來治療出血性膀胱炎, 可同時達(dá)到止血和促進(jìn)受損上皮組織再生修復(fù)的作用。
4.在以往使醫(yī)生感到頭痛的耳鼻喉科疾病及相關(guān)手術(shù)出血的處理上, 采用直接灌注凝血酶或用凝血酶液浸濕的明膠海綿敷貼出血處, 可得到滿意的止血效果, 減輕病人痛苦。
5.不僅在腦出血、腦缺血中有毒性作用, 在中樞神經(jīng)系統(tǒng)正常發(fā)育和損傷保護(hù)中也有重要作用。口服或灌注：用于消化道出血，將本品用溫開水或生理鹽水(不超過37℃)溶解成10～100U/ml的溶液，每次 1000～4000U，也可根據(jù)出血部位及程度適當(dāng)增減濃度、次數(shù)。
局部用藥：①一般劑量為將本品用滅菌生理鹽水溶解成 50～200U/ml的溶液，噴霧創(chuàng)面。 ②大量出血時，可使用明胺海綿紗條或氧化纖維素蘸取本品溶液貼于創(chuàng)面或?qū)⒏煞蹏姙⒂趧?chuàng)面。③整形外科、拔牙、皮膚移植、肝素化患者穿刺部位滲血，常用本品100U/ml溶液止血。 ④肝脾破裂大出血止血采用凝血酶溶液1000～2000U/ml。1.偶可致過敏反應(yīng)，應(yīng)立即停藥，并進(jìn)行抗過敏治療。
2.凝血酶誤入血管可致血管內(nèi)凝血（血栓形成）而危及生命。
3.外科止血中應(yīng)用凝血酶曾有致低熱反應(yīng)的報道。1.本品必須直接與創(chuàng)面接觸，才能起止血作用；應(yīng)新鮮配制使用。
2.嚴(yán)禁作血管內(nèi)、肌內(nèi)或皮下注射，以防引起局部壞死甚至形成血栓而危及生命。
3.加溫，酸、堿或重金屬鹽類可使其活力下降而失去作用。
4.如出現(xiàn)過敏反應(yīng)癥狀時應(yīng)停藥。
5.妊娠期僅在具有明顯指征下，病情必要時才能使用。凝血酶為牛血或豬血中提取的凝血酶原，經(jīng)激活而得凝血酶的無菌凍干品，為白色或類白色的凍干塊狀物或粉末。干粉在2～8⁰C儲存很穩(wěn)定，干粉易溶于水，0.9％的氯化鈉溶液顯渾濁，不溶于有機(jī)溶劑。在室溫水溶液8h內(nèi)失活。故須臨用時新鮮配制，遇熱、稱酸、堿、金屬等活力降低。凝血酶為局部止血藥，局部應(yīng)用無副作用。使用時必須直接與創(chuàng)面接觸，才能起到止血作用。但是本品嚴(yán)禁注射，不得與酸、堿及重金屬配伍。動物試驗有機(jī)抗原體反就、過敏反應(yīng)。如出理此癥狀，應(yīng)立即停藥。
局部止血用氯化鈉注射液溶解成含50～250單位/ml的溶液或干粉，噴霧或灑于創(chuàng)傷表面。消化道止血，用溫開水（≤37⁰)溶解成10～100單位/ml的溶液，品服或局部灌注，根據(jù)出血部位及程度適當(dāng)增減濃度、次數(shù)。局部止血藥，用于局部出血及消化道出血生化研究原料處理、沉淀取豬血液2kg，加入枸櫞酸鈉（38g/L即3.8%)溶液200ml抗凝，混勻，離習(xí)分離，取出上清液血漿，在血漿加入10倍于血漿量的蒸餾水稀釋，用300ml乙酸（1％）調(diào)節(jié)Ph為5.3，待沉淀完全，于離心機(jī)中離心5～10min，棄去離心液，收集沉淀，得凝血酶原。
動物血液^枸櫞酸鈉→_原料處理血漿^{蒸餾水：HAc;Ph5.3}→_沉淀凝血酶原
分離、沉淀、洗滌取凝血酶原，在25～ 30C⁰下，加入氯化鈉（0.9%)的溶液700ml,使之溶解，再在每升溶液中加入15g氯化鈣，充分?jǐn)嚢?0min，使之溶解，冷室置1h，離心分離，取上清液加等量冷凍丙酮，攪拌均勻后，靜置過夜。離心分離，沉淀再加冷凍丙酮研細(xì)，冷室放置2～ 3d,過濾，得沉淀后用乙醚洗滌，真空干燥，即得粗制凝血酶，約10g。
凝血酶原^{NaCl;CaCl₂;丙酮}→_{分離；沉淀}沉淀^乙醚→_洗滌粗制凝血酶
除雜質(zhì)、沉淀、干燥在粗制凝血酶中加入200ml氯化鈉液（9g/L），使之溶解，溶解后0⁰C放置6h，過濾，取沉淀再加150ml氯化鈉液（9g/L）重復(fù)以上操作1次，合并兩次濾液。用乙酸（1%)調(diào)節(jié)Ph至5.5。離心分離，沉淀棄去，取上清液加入2倍于上清液量的冰凍丙酮，靜置2h，待沉淀完全，離心分離，沉淀用冷凍丙酮研細(xì)，放置24h，濾去溶液。沉淀分別用無水乙醇、乙醚洗滌，真空干燥，即得精致凝血酶，約0.4g。粗制凝血酶^{NaCl;HAc;^0<0}C;pH5.5→濾液^丙酮→_沉淀干燥精制成品