背景[1-7]
RNA克隆是將載體用限制性內(nèi)切酶雙酶切得到線性化的載體；需要同時合成兩種序列不完全相同的寡核苷酸片段，這兩種寡核苷酸片段在退火后形成雙鏈DNA片段；載體和雙鏈DNA片段通過T4 DNA連接酶連接，得到環(huán)型的DNA分子。最后將連接得到的DNA分子轉(zhuǎn)化細(xì)菌，通過篩選得到正確的基因克隆。
體外轉(zhuǎn)錄合成ShRNAs法，是按照生命合成RNA過程的原理，用轉(zhuǎn)錄方法來合成ShRNAs，其ShRNA最接近生命自然狀態(tài)中的dsRNA，RNA干擾效果也。較化學(xué)合成而言，體外轉(zhuǎn)錄制備ShRNA的優(yōu)勢在于成本低、質(zhì)量高、毒性小和穩(wěn)定性均較好。
轉(zhuǎn)錄ShRNAs只要較低的濃度就可以達(dá)到化學(xué)合成ShRNAs較高濃度得到的效果；而且，直接使用dsRNA易轉(zhuǎn)染，非常有效，使用范圍也較廣。但是，由于在哺乳動物中不存在RNAi的擴(kuò)增機(jī)制，導(dǎo)入RNA產(chǎn)生的RNAi作用不可避免的具有瞬時性。為了克服這個弱點，現(xiàn)已發(fā)展了基于DNA載體在體內(nèi)表達(dá)siRNA的技術(shù)，即編碼ShRNA的轉(zhuǎn)錄DNAs法。
小干擾核糖核酸(siRNA)具有基因沉默作用，發(fā)夾狀核糖核酸(ShRNA)是siRNA的一種。有研究顯示，無論是根據(jù)微小核糖核酸(miRNA)設(shè)計的ShRNA，或基于siRNA的ShRNA在體內(nèi)都表現(xiàn)出有效地基因抑制作用，效果較別的siRNA方法更好。ShRNA的常規(guī)制備方法主要有兩種體外轉(zhuǎn)錄合成ShRNAs法和編碼ShRNA的轉(zhuǎn)錄DNAs法。
應(yīng)用[8][9]
可用于非編碼RNA克隆分析及其功能初步研究：
不編碼蛋白質(zhì)的RNA分子—非編碼RNA(noncoding RNA,ncRNA)被大量發(fā)現(xiàn),與已知的mRNA、rRNA及tRNA不同,它們不直接參與蛋白質(zhì)的合成。非編碼RNA在各種生物中廣泛存在,它的種類繁多,主要包括:類mRNARNA、microRNA(miRNA)、snRNA、snoRNA、scRNA、pRNA、SRP-RNA、gRNA等。非編碼RNA可影響轉(zhuǎn)錄及染色質(zhì)的結(jié)構(gòu),參與RNA的加工修飾,調(diào)節(jié)mRNA的穩(wěn)定性及翻譯,還可以影響蛋白質(zhì)的穩(wěn)定和轉(zhuǎn)運(yùn)。
ncRNA以多種機(jī)制發(fā)揮這些作用,如:RNA-RNA(DNA)堿基配對、RNA-蛋白質(zhì)相互作用、模擬其他核酸分子或直接起催化作用。microRNA及類mRNA RNA是兩類非常重要的非編碼RNA分子,已有的研究結(jié)果表明它們與細(xì)胞的生長和分化、胚胎的發(fā)育、腫瘤的形成和抑制都有著密切的關(guān)系。本論文對這兩種非編碼RNA分別在發(fā)育、腫瘤及衰老過程中的作用進(jìn)行了初步研究。 microRNA是一類20-25個堿基可調(diào)控其他基因表達(dá)的小分子非編碼RNA,它廣泛存在于各種真核生物中。
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