背景及概述^[1][2]

活性氧包括超氧陰離子、羥基自由基、過(guò)氧化氫、單線態(tài)氧等，這些粒子均十分微小。由于存在未配對(duì)的自由電子，活性氧的化學(xué)性質(zhì)十分活躍?；钚匝跬巧锷^(guò)程中的一種副產(chǎn)品，當(dāng)其過(guò)量時(shí)，機(jī)體內(nèi)的活性氧會(huì)對(duì)細(xì)胞和基因結(jié)構(gòu)造成損壞，引發(fā)多種疾病，如細(xì)胞毒性、衰老、癌癥等。超氧陰離子是其他幾種活性氧的源頭，超氧化物歧化酶能夠清除機(jī)體中過(guò)量的超氧陰離子，它能夠催化超氧陰離子發(fā)生歧化反應(yīng)，產(chǎn)生氧氣和過(guò)氧化氫，具有抗炎、抗病毒、抗衰老等作用。

活性測(cè)定方法^[1]

現(xiàn)有的測(cè)定超氧化物歧化酶活性的方法主要是黃嘌呤氧化酶-NBT法、 腎上腺素自氧化法、Marklund鄰苯三酚法、化學(xué)發(fā)光法等。但是黃嘌 呤氧化酶-NBT法中，NBT產(chǎn)物甲臜水溶性差，需要加入助溶劑增加水溶 性，因此此法應(yīng)用有一定的限制。腎上腺素自氧化法和Marklund鄰苯 三酚法是根據(jù)腎上腺素和鄰苯三酚在堿性條件下自氧化，產(chǎn)生超氧陰離子和有色物質(zhì)，根據(jù)有色物質(zhì)的含量變化測(cè)定超氧化物歧化酶活性 ，但是有色物質(zhì)不穩(wěn)定，存在時(shí)間短，因此測(cè)定有誤差，重現(xiàn)性較差 。化學(xué)發(fā)光法是通過(guò)使用化學(xué)發(fā)光劑使體系產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光，間接的檢 測(cè)超氧陰離子的方法，該方法由于發(fā)光時(shí)間短暫，測(cè)定困難并易產(chǎn)生誤差，重現(xiàn)性較差。

CN201210341599.6提供一種測(cè)定超氧化物歧化酶活性的方法，該方法包括以下步驟：

步驟a、超氧陰離子產(chǎn)生體系緩沖溶液的配制

配制濃度為50毫摩爾/升的碳酸氫銨緩沖溶液，調(diào)節(jié)pH值為9.3；

步驟b、標(biāo)準(zhǔn)品的配制

用步驟a中的碳酸氫銨緩沖溶液將標(biāo)準(zhǔn)品配成濃度為50微摩爾/升的標(biāo) 準(zhǔn)溶液，所述的標(biāo)準(zhǔn)品為2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2'4-二磺基苯 )-2H-四氮唑鈉鹽，能和超氧陰離子反應(yīng)產(chǎn)生水溶性甲臜染料；

步驟c、對(duì)照品、樣品和空白樣品的制備

對(duì)照品的制備：反應(yīng)總體積160微升，先加入40微升2毫摩爾/升乙二胺 四乙酸二鈉鹽，加入40微升生理鹽水，加入40微升50微摩爾/升的2-( 4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2'4-二磺基苯)-2H-四氮唑鈉鹽，最后加入40微升1毫摩爾/升鄰苯三酚水溶液，37℃反應(yīng)12分鐘后，作為對(duì)照品，供內(nèi)置紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)的酶標(biāo)儀測(cè)定；

樣品的制備：反應(yīng)總體積160微升，先加入40微升2毫摩爾/升乙二胺四乙酸二鈉鹽，加入40微升3.12毫克/升超氧化物歧化酶標(biāo)準(zhǔn)品溶液（生理鹽水溶解的），加入40微升50微摩爾/升的2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2'4-二磺基苯)-2H-四氮唑鈉鹽，最后加入40微升1毫摩爾/升鄰苯三酚水溶液，37℃反應(yīng)12分鐘后，作為樣品，供內(nèi)置紫外可見(jiàn)分光 光度計(jì)的酶標(biāo)儀測(cè)定；

空白樣品的制備：反應(yīng)總體積160微升，先加入40微升2毫摩爾/升乙二 胺四乙酸二鈉鹽，加入40微升3.12毫克/升超氧化物歧化酶標(biāo)準(zhǔn)品溶液 （生理鹽水溶 解的），加入40微升50微摩爾/升的2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2' 4-二磺基苯)-2H-四氮唑鈉鹽，最后加入40微升水溶液，37℃反應(yīng)12分鐘后，作為空白樣品，供內(nèi)置紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)的酶標(biāo)儀測(cè)定；

步驟d、對(duì)照品、樣品和空白樣品的檢測(cè)

對(duì)照品檢測(cè)：以96孔板為載體，在內(nèi)置紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)的酶標(biāo)儀中進(jìn)行測(cè)定，設(shè)定紫外-可見(jiàn)檢測(cè)波長(zhǎng)為450納米，對(duì)步驟c制備的對(duì)照品進(jìn)行測(cè)定，得到對(duì)照品的吸光度值A(chǔ)對(duì)照品；

樣品檢測(cè)：以96孔板為載體，在內(nèi)置紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)的酶標(biāo)儀中 進(jìn)行測(cè)定，設(shè)定紫外-可見(jiàn)檢測(cè)波長(zhǎng)為450納米，對(duì)步驟c配制的樣品進(jìn)行測(cè)定，得到樣品的吸光度值A(chǔ)樣品；

空白樣品檢測(cè)：以96孔板為載體，在內(nèi)置紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)的酶標(biāo)儀中進(jìn)行測(cè)定，設(shè)定紫外-可見(jiàn)檢測(cè)波長(zhǎng)為450納米，對(duì)步驟c配制的空白樣品進(jìn)行測(cè)定，得到空白樣品的吸光度值A(chǔ)空白樣品；

步驟e、超氧化物歧化酶的活性的計(jì)算

超氧化物歧化酶對(duì)超氧陰離子的清除率按照以下公式計(jì)算：

I樣品=[A對(duì)照品-（A樣品-A空白樣品）]/A對(duì)照品×100%

式中，I為超氧化物歧化酶對(duì)超氧陰離子的清除率；

A對(duì)照品為對(duì)照品中2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2'4-二磺基苯)-2H-四氮 唑鈉鹽的產(chǎn)物水溶性甲臜的吸光度值，無(wú)量綱；

A樣品為樣品中2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2'4-二磺基苯)-2H-四氮唑 鈉鹽的產(chǎn)物水溶性甲臜的吸光度值，無(wú)量綱；

A空白樣品為空白樣品中2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2'4-二磺基苯)-2H-四 氮唑鈉鹽的產(chǎn)物水溶性甲臜的吸光度值，無(wú)量綱；

超氧化物歧化酶活性的計(jì)算公式如下：

超氧化物歧化酶活性=I/(1–I)

根據(jù)測(cè)得的對(duì)照品、樣品和空白樣品中2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5- (2'4-二磺基苯)-2H-四氮唑鈉鹽的產(chǎn)物水溶性甲臜的吸光度值A(chǔ)對(duì)照品、A樣品和A空白樣品，經(jīng)計(jì)算得到0.78毫克/升超氧化物歧化酶標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)超氧陰離子的清除率為42%，進(jìn)而得出超氧化物歧化酶標(biāo)準(zhǔn)品的活性為5.8U/μg。

分離提純^[2]

一種利用結(jié)晶法分離提純超氧化物歧化酶的方法，其特征在于步驟如下：

步驟1：利用超聲破碎儀將細(xì)菌發(fā)酵培養(yǎng)液破碎后，離心取上清，用鹽酸調(diào)節(jié)蛋白 質(zhì)溶液pH值至酸性，0℃-4℃靜置1h-3h后，離心取上清，超濾濃縮后得到蛋白質(zhì)溶液；

步驟2：將沉淀劑溶解在0.1-5mM，pH值為3.0-5.5的檸檬酸溶液中，與蛋白質(zhì)溶液 按1:1體積比混合后，加入10-200μL籽晶，置于控溫箱中，在4℃-20℃中攪拌結(jié)晶；所述沉淀 劑為PEG8000，濃度為20-80mg/mL；

步驟3：將結(jié)晶完成后的溶液離心后取沉淀，所得沉淀即為超氧化物歧化酶晶體混合物；

步驟4：加入超氧化物歧化酶晶體清洗溶液，緩慢攪拌混勻后，離心棄上清，重復(fù)該 過(guò)程多次以徹底清洗晶體，得到超氧化物歧化酶晶體；所述晶體清洗溶液為20-100mg/mL的 PEG8000溶液；

步驟5：將所得晶體凍干，得到白色粉末狀超氧化物歧化酶成品，或不凍干，直接作為晶體制劑應(yīng)用。

對(duì)于步驟4得到的超氧化物歧化酶晶體溶解后的溶液取代步驟2的蛋白質(zhì)溶液，采用與步驟2相同的結(jié)晶條件重復(fù)結(jié)晶多次，使所制得的超氧化物歧化酶晶體純度更高。

主要參考資料

[1] CN201210341599.6 一種測(cè)定超氧化物歧化酶活性的方法

[2] [中國(guó)發(fā)明] CN201810289241.0 一種利用結(jié)晶法分離提純超氧化物歧化酶的方法